黑老虎果实中1 个新的联苯环辛烯型木脂素

刘 健 ，陶袁志，吴沁昱，马 静，陈俐亲，吴文明，金 岸 *

1.南华大学药学院，湖南 衡阳 421200

2.湖南医药学院药学院，湖南 怀化 418000

3.江西省人民医院（南昌医学院第一附属医院）药学部，江西 南昌 330006

黑老虎Kadsuracoccinea(Lem.) A.C.Smith 为五味子科南五味子属常绿木质藤本植物，原产于中国南部[1]，其根茎在民间常用来治疗胃肠疾病和类风湿性关节炎[2-3]。据文献报道，从黑老虎中分离得到的化学成分有三萜、倍半萜、木脂素、甾体、单萜和氨基酸类等[4]。其中，木脂素和三萜类成分作为黑老虎的主要化学成分，具有抗炎、抗肿瘤、抗艾滋病病毒和保肝等功效[5-7]。目前，对于黑老虎化学成分的研究主要集中在根和藤茎上，而对于果实部位研究相对较少。

黑老虎果实民间又被称为“血藤果”“布福娜”“冷饭团”。黑老虎果实除含有丰富的维生素、氨基酸及多种微量元素外，还具有广泛的药用价值[8]，因此可作为一种功能性水果进行开发利用。据相关文献报道，黑老虎果实中提取到的木脂素类成分具有一定的抗艾滋病病毒[9]及保肝活性[10]，多酚与花色苷类成分具有抗氧化活性[11]。为进一步揭示黑老虎果实中的化学成分，丰富黑老虎化学成分结构类型，本实验从干燥的黑老虎果实中分离鉴定了11 个单体化合物（图1），其中，化合物1 为新化合物，鉴定为 (aS,7R,8R,8'S,7'R)-7-苄酰氧基-7,7',8,8'-四氢-4,5-亚甲二氧基-3,3',4',5',7'-五甲氧基-8,8'-二甲基-二苯并[a,c]环辛烯 ｛(aS,7R,8R,8'S,7'R)-7-dibenzoyloxy-7,7',8,8'-tetrahydro-4,5-methylenedioxy-3,3',4',5',7'-pentamethoxy-8,8'-dimethyl-dibenzo[a,c]cycloocten，1｝，已知化合物分别鉴定为3,4-二羟基-3',4'-二甲氧基-6,7'-环木脂素（3,4-dihydroxy-3',4'-dimethoxy-6,7'-cyclolignan，2）、kadsuralignan H（3）、(＋)-(8S,8'R)-4,4'-二羟基-3,3',5'-三甲氧基木脂烷 [(＋)-(8S,8'R)-4,4'-dihydroxy-3,3',5'-trimethoxylignan，4]、前戈米辛（pregomisin，5）、松脂醇（pinoresinol，6）、aromadendrane-4β,10β-diol（7）、nephthediol（8）、oplodiol（9）、1β,11-dihydroxy-5-eudesmene（10）、pubinernoid A（11）。化合物1 命名为血藤果素A，化合物2、4、7～11 为首次从该属中分离得到。同时，对分离得到的11 个单体化合物开展了抗炎活性评价。

图1 化合物1～11 的结构Fig.1 Structures of compounds 1—11

1 仪器与材料

LTQ-Orbitrap XL 质谱仪（赛默飞公司，美国）；Bruker Avance（400、500 MHz）核磁共振波谱仪（布鲁克公司，德国）；Autopol Ⅳ型旋光仪（鲁道夫公司，美国）；J-810 型圆二色光谱仪（佳司科公司，日本）；快速纯化制备色谱仪（三泰科技有限责公司，常州）；柱色谱硅胶（40～63 μm，三泰科技有限责公司，常州）；Sephadex LH-20 凝胶（GE 公司，美国）；MCI 小孔树脂（75～150 μm，三菱化学，日本）；Easysep-3030 Unimicro 全自动高效液相色谱仪（通微公司，上海）；MULTISKAN MK3 酶标仪（赛默飞公司，美国）；十八烷基硅烷键合填料（C18，50 μm，YMC 公司，日本）；SHIMADZU LC-20A 制备液相色谱仪（岛津公司，日本）；色谱柱ZORBAX Bonus-RP（150 mm×21.2 mm，7 μm，安捷伦公司制备柱，美国）及Eclipse XDB-C18（250 mm×9.4 mm，5 μm，安捷伦公司半制备柱，美国）；色谱级甲醇（迈瑞达公司）；分析纯试剂（奥普升化工有限公司，天津）。DMEM（批号SH30243.01B，Hyclone公司，美国），胎牛血清（批号SH30084.03，Hyclone公司，美国）；PBS（批号C10010500BT，Life 科技公司，美国），胰酶（批号25200072，GIBCO 公司，美国），MTT（批号M5655-1G，Sigma 公司，上海）；L-NIL（批号HY-12116，MCE 公司，美国）；总一氧化氮检测试剂盒（批号S0023，上海碧云天公司）。

样品于2018 年采自湖南省怀化市通道县，经湖南医药学院汪冶教授鉴定为南五味子属植物黑老虎K.coccinea(Lem.) A.C.Smith 的成熟果实。样品（201801）保存于湖南医药学院药学院。

2 方法

2.1 提取与分离

取黑老虎干燥果实（32 kg），粉碎后加入75%的乙醇冷浸提取4 次，浓缩得到粗提物浸膏。加适量水将浸膏混悬，用石油醚萃取5 次并收集萃取液，浓缩得到石油醚部位的浸膏1.2 kg。石油醚浸膏用硅胶拌样后经硅胶柱色谱粗分，以石油醚-醋酸乙酯（15∶1～0∶1）梯度洗脱得到12 个组分（Fr.A～L）。

Fr.B（205 g）首先用MCI 柱（甲醇～水1∶3→1∶0）分离成4 个部分Fr.B1～B4。Fr.B1（50 g）用快速纯化制备色谱仪经ODS 色谱柱（甲醇～水1∶4→1∶0）得到馏分Fr.B1-1～B1-11，其中Fr.B1-5 经Sephadex LH-20 凝胶柱（二氯甲烷～甲醇1∶1）色谱分离得到2 个组分Fr.B1-5-1 和Fr.B1-5-2，Fr.B1-5-2 经反相制备型高效液相色谱（65%甲醇）得到化合物2（10.5 mg）和5（13.2 mg）；Fr.B1-8 经半制备HPLC 分离得到化合物1（6.5 mg，tR＝5.5 min；甲醇-水60∶40，3 mL/min）、化合物3（7.4 mg，tR＝6.1 min；甲醇-水60∶40，3 mL/min）和Fr.B1-8-1（14.4 mg，tR＝12.3 min；甲醇-水60∶40，3 mL/min），Fr.B1-8-1 再经半制备色谱柱反复纯化得到化合物4（6.2 mg，tR＝19.8 min；甲醇-水55∶45，3.3 mL/min）和化合物6（6.8 mg，tR＝17.8 min；甲醇-水55∶45，3.3 mL/min）。Fr.C 浸膏（140 g）通过MCI 梯度洗脱（甲醇-水1∶3→1∶0）后得到6 个组分Fr.C1～C6，其中的Fr.C3 经Sephadex LH-20（二氯甲烷-甲醇1∶1）柱色谱分离到4 个组分Fr.C3-1～C3-4，Fr.C3-2 经ODS 色谱柱（甲醇-水1∶4→1∶0）梯度洗脱得到4 个组分Fr.C3-2-1～C3-2-4，Fr.C3-2-2 经半制备HPLC 得到化合物9（9.3 mg，tR＝10.8 min；甲醇-水60∶40，3 mL/min）和10（8.5 mg，tR＝15.8 min；甲醇-水60∶40，3 mL/min），Fr.C3-2-3 经重结晶得到化合物8（11.3 mg）；Fr.C3-3 经ODS 开放柱（甲醇-水1∶3→1∶0）及半制备HPLC 进一步纯化得到化合物7（7.4 mg，tR＝10.4 min；甲醇-水65∶35，3 mL/min）和11（6.7 mg，tR＝13.5 min；甲醇-水65∶35，3 mL/min）。

2.2 抗炎活性测定

2.2.1 细胞毒性实验 取正常生长的RAW264.7 细胞，以1×104个/孔接种到96 孔细胞培养板中，于5% CO2、37 ℃培养箱中培养过夜。以添加不含药物的培养基作为对照组，以分别加入终浓度为100 μmol/L 的待测样品（1～11）为给药组，每组设3 个复孔，继续在5% CO2、37 ℃条件下培养24 h。采用MTT 法测定并计算细胞存活率。若化合物对RAW264.7 细胞有毒性，则选择更低浓度重复上述实验，直至筛选到对RAW264.7 细胞无明显毒性的浓度，再以此浓度进行抗炎活性实验。

2.2.2 抗炎活性筛选 取正常生长的RAW264.7 巨噬细胞，以5×104个/孔接种于24 孔细胞培养板中，并于5% CO2、37 ℃培养箱中培养过夜。诱导型NO合成酶抑制剂（L-NIL）为阳性对照。设置空白对照组、LPS（1 μg/mL）组、LPS（1 μg/mL）＋L-NIL（30 μmol/L）组和LPS（1 μg/mL）＋化合物1～11（化合物3、5 用20 μmol/L，化合物2、4 用50 μmol/L，其余用100 μmol/L），培养24 h 后，收集上清液，按照NO 试剂盒说明书检测NO 含量。

3 结果

3.1 结构鉴定

1H-NMR 和13C-NMR 谱中（表1）显示2 个芳香质子信号δH6.53 (1H, s, H-6), 6.63 (1H, s, H-6') 和12 个芳香碳信号δC133.4 (C-1), 121.4 (C-2), 141.7(C-3), 136.2 (C-4), 148.6 (C-5), 102.8 (C-6), 133.0 (C-1'), 123.7 (C-2'), 151.9 (C-3'), 141.7 (C-4'), 152.1 (C-5'), 111.1 (C-6')，5 个甲氧基信号δH3.86 (3H, s), 3.09(3H, s), 3.58 (3H, s), 3.99 (3H, s), 3.04 (3H, s)，1 个亚甲二氧基质子信号δH5.96 (2H, overlapped)，由此推测化合物1 中存在联苯基团。在1H-1H COSY 谱（图2）中可看出-CH (H-7)-CH (H-8)-CH (H-8')-CH(H-7')-，-CH (H-8)-CH3(H-9)-和-CH (H-8')-CH3(H-9')-3 个相连片段；HMBC 谱（图2）中H-7 与C-2, 6相关，H-6'与C-7'相关，H-9 同C-7, 8, 8'相关，H-9'同C-7', 8'存在相关信号。以上数据表明化合物1具有联苯环辛烯类木脂素的基本骨架。此外，1H NMR 谱中证实化合物中还存在2 个甲基信号δH1.08 (3H, d,J= 7.3 Hz, H-9) 和1.03 (3H, d,J= 7.2 Hz, H-9')；13C NMR 谱中还显示存在1 组苄酰氧基信号δC166.0 (C-1''), 129.8 (C-2''), 129.9 (C-3'', 7''),128.2 (C-4'', 6''), 132.1 (C-5'')[12]。

表1 化合物1 的1H- 和13C-NMR 数据 (400/100 MHz, CDCl3)Table 1 1H- and 13C-NMR data of compound 1 (400/100 MHz, CDCl3)

图2 化合物1 的结构以及主要HMBC、1H-1H COSY 相关Fig.2 Structure of compound 1 and key HMBC, 1H-1H COSY correlations

结合HMBC 谱分析，5 个甲氧基信号分别与C-3、C-3'、C-4'、C-5'、C-7'相关，由此确定5 个甲氧基分别位于C-3、C-3'、C-4'、C-5'和C-7'。亚甲二氧基质子信号与C-4 和C-5 有关联表明该基团连在C-4 和C-5 位上。H-7 (δH6.05, 1H, s) 和C-1''(δC166.0) 的HMBC 相关性证实了C-7 上存在苄酰氧基。根据以上数据分析得到化合物1 的平面结构。CD 谱中显示在225 nm 附近呈现正的Cotton 效应，240 nm 附近则呈现负值，表明1 具有S-联苯构型[13]。同时在NOESY 谱中（图3）显示H-6 与H-7, H-8 相关，H-6'与H-7', H3-9'相关，以及H3-9 与H3-9'相关，表明H-7'，CH3-9'和CH3-9 是α 构型，H-7 是β 构型，化合物1 中的环辛二烯结构符合扭曲船椅式[14]，其绝对构型为：C-7 (R), C-8 (R), C-8'(S), C-7'(R)。故化合物1 的结构鉴定为(aS,7R,8R,8'S,7'R)-7-苄酰氧基-7,7',8,8'-四氢-4,5-亚甲二氧基-3,3',4',5',7'-五甲氧基-8,8'-二甲基-二苯并[a,c]环辛烯。经Scifinder 数据库检索为新化合物，命名为血藤果素A。

图3 化合物1 的重要NOESY 相关Fig.3 Key NOESY correlations of compound 1

3.2 抗炎实验

3.2.1 细胞毒性评价 采用MTT 法，首先测定了在100 μmol/L 浓度下化合物1～11 对RAW264.7 细胞的毒性。结果表明（图4），在100 μmol/L 浓度下，化合物3 和5 显示出较强的细胞毒性，RAW264.7 细胞的存活率分别为2.00%和12.38%；化合物2 和4 具有一定的细胞毒性，RAW264.7 的存活率分别为75.32%和63.73%。因此，选择更低浓度测定化合物2～5 对RAW264.7 细胞的毒性。最终，化合物2 和4 在50 μmol/L 下，化合物3 和5 在20 μmol/L 下对RAW264.7 细胞无明显毒性。

图4 RWA264.7 细胞化合物1～11 作用下的存活率Fig.4 Survival rates of RWA264.7 cells under effects of compounds 1—11

图 5 化合物1～11 对LPS 诱导RWA264.7 细胞生成NO的影响Fig.5 Effect of compounds 1-11 on NO production in RWA264.7 cells induced by LPS

3.2.2 抗炎活性的评价 本实验选择化合物3、5 浓度为20 μmol/L，化合物2、4 浓度为50 μmol/L，其余化合物浓度为100 μmol/L。结果表明（图5），与LPS 组相比而言，所有的化合物对NO 的释放都有一定的抑制效果，其中化合物4 在抑制NO 释放上展示出更好的效果，抑制率为64.45%。30 μmol/L 的L-NIL 作为阳性对照，抑制率为74.57%。

4 讨论

本研究从黑老虎果实的乙醇提取物中分离得到11 个多种类型的化合物包括1 个新的联苯环辛烯型木脂素、2 个环木脂素、2 个简单木脂素、1 个双环氧木脂素、4 个倍半萜及1 个单萜，充分的表明黑老虎果实中存在木脂素和萜类等化学成分。同时，本次研究发现，在100 μmol/L 时，化合物3 和5 对RAW264.7 细胞表现出较强的毒性。在浓度为50 μmol/L，无细胞毒性的条件下，化合物4 在抑制LPS诱导的RAW264.7 细胞释放NO 上表现出较好的效果，表明具有一定的抗炎活性。此外，黑老虎果实中除含有丰富的木脂素外，萜类成分也需得到足够的关注，值得进行深入研究，同时也为后续资源利用和产品开发奠定基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突