1例输入性类鼻疽的病原学诊断及溯源分析

杨红霞,王春雨,王 洋,郝瑞娥,赵启玉,郑 宵

类鼻疽(Melioidosis)是一种由类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderiapseudomallei)感染引起的人兽共患传染病。主要流行于东南亚,尤其是马来西亚、泰国、新加坡以及澳洲北部等南北纬20°之间的地区[1-3],2015年全球类鼻疽发病数估算约165 000例,死亡约89 000例[4]。在我国主要流行于海南、广东及广西等地区,在北方地区则较少见报道[5]。

该病临床表现复杂多变,以肺炎、败血症、局部脓肿为主。类鼻疽伯克霍尔德菌是一种环境腐生菌,广泛存在于水体、土壤等生活环境,对人和动物均具有高度致病性。类鼻疽伯克霍尔德菌侵入人体肺部后,容易形成难治性肺炎、肺部空洞,并可能短期内快速发展为败血症而死亡。此外,类鼻疽伯克霍尔德菌还可能引起脑膜炎、前列腺炎、尿路感染及内脏脓肿[6-7]。尽管类鼻疽的发现已有100多年,但因其临床症状多样化,使得漏诊、误诊率及病死率均较高。因此,该病的病原学诊断尤为重要。

该病例是山西省报道的从1例感染发热的患者血液标本中分离鉴定出类鼻疽伯克霍尔德菌,为明确其诊断和溯源,通过流行病学调查和全基因测序等方法,对该病例进行溯源分析,不仅为全面了解类鼻疽伯克霍尔德菌的分子流行病学特征奠定了基础,还为山西省预防该病的流行及传播提供了建议。

1 材料与方法

1.1 病史 患者为男性,21岁,学生,山西人。患者自述在2022年7月1日至6日在海南旅游。于7月5日上午出现头晕、咽痛,随后出现恶心、干呕、乏力、四肢肌肉酸痛、无法行走,当晚前往三亚市级医院就诊,测体温39.0 ℃,当地医院给予头孢抗炎、补液、退热等治疗(具体不详)。返回太原后,于7月9日就诊于山西省人民医院急诊,入院诊断为:紫癜性肾炎、发热原因待查、右侧胸背部疼痛待查。患者于2022年2月曾确诊“紫癜性肾炎IIb型”。入院后进行血培养阳性,分离菌株经微生物质谱仪(德国布鲁克)鉴定显示为泰国伯克霍尔德菌(Burkholderiathailandensis),进行药敏实验(VITEK-2 COMPACT法国梅里埃,全自动微生物生化鉴定仪,革兰氏阴性菌药敏卡AST-GN09)。临床会诊后考虑患者自述在海南旅游期间曾有淋雨史,结合患者症状、体征,不能除外类鼻疽伯克霍尔德菌感染可能,遂将菌株送至山西省疾控中心进一步鉴定。7月21日山西省疾控中心鉴定为类鼻疽伯克霍尔德菌。临床继续给予美罗培南(2 g/d,静脉滴注)抗感染治疗,病情迅速得以控制,15 d后患者好转出院。

1.2 细菌鉴定 我中心收到菌株后立即接种哥伦比亚血平板和营养琼脂平板,37 ℃培养24 h后进行鉴定。观察菌落形态,涂片革兰染色。采用甲酸提取法,将细菌灭活后使用微生物质谱仪(德国布鲁克MALDI-TOF MS)进行鉴定[8],同时采用API 20NE(法国梅里埃)做系统生化鉴定。

1.3 核酸提取及全基因测序 挑取菌落制成菌悬液,按照细菌DNA基因组核酸提取试剂盒说明书(德国QIAamp DNA 试剂盒)提取核酸。送北京诺禾致远科技股份有限公司进行全基因测序。测序平台为Illumina Novaseq 6000,测序文库大小为350 bp,对基因组进行PE150双末端高通量测序。基因组序列组装、测序数据的质控、组装和基因注释分别采用FastQC、SPAdes v.3.13.1和Prokka v.1.14软件。

1.4 耐药基因分析 使用ResFinder 4.0软件(https://bitbucket.org/genomicepid emiology/resfinder/src/master/)筛选菌株耐药基因。参数设置为比对最小覆盖度为60%,核酸比对相似性最小为80%。

1.5 多位点序列分型 (multilocus sequence typing,MLST) 将组装好的菌株序列上传至 MLST数据库(https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_bpseudo mallei_seqdef),针对类鼻疽伯克霍尔德菌的ace、gltB、gmhD、lepA、lipA、narK、ndh7个管家基因进行比对匹配,获得其所属 ST型。从数据库选取我国自1975至今上传的类鼻疽伯克霍尔德菌共314株92个ST型,采用Bionumerics BN7.6软件进行MLST聚类分析。

1.6 系统发育进化关系分析 通过美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)网站搜索类鼻疽伯克霍尔德菌所有已测序组装的基因组序列,筛选来自全球多个国家及地区,以及海南省相近ST型代表株与本研究分离株共54条全基因组序列做系统发育进化分析。采用全基因组测序单核苷酸多态性(WGS single nucleotide polymorphism,wgSNP)数据构建进化树,利用fasttree软件对wgSNP序列构建进化树,使用pyani(https://github.com/widdowquinn/pyani)的ANIb算法计算菌株间基因组序列的相似性(ANI)。

2 结 果

2.1 菌株鉴定 将菌株接种于哥伦比亚血平板上,培养24 h发现有菌落生长,为圆形、湿润、突起、透明或半透明小菌落,边界完整;培养3 d后,形成干燥的白色菌落,表面有皱褶,多呈放射状。革兰氏染色阴性,卵圆形短小杆菌,菌体两端浓染,见图1。微生物质谱仪鉴定结果为类鼻疽伯克霍尔德菌。API 20NE生化反应显示,硝酸盐还原实验、精氨酸、明胶、葡萄糖、甘露醇及氧化酶等反应阳性,编码为1156577,鉴定为类鼻疽伯克霍尔德菌,菌株编号SX22_3027BPD。

图1 类鼻疽伯克霍尔德菌革兰染色(1 000×)Fig.1 Gram stain characteristics of B. pseudomallei isolates(1 000×)

2.2 抗生素药物敏感试验情况 采用微量肉汤稀释法检测菌株对常用抗生素的最小抑菌浓度 (minimum inhibitory concentration,MIC),包括下列抗生素:哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢唑啉、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明/磺胺甲恶唑。质控菌株为大肠埃希菌 ATCC25922。药敏试验判读结果参照美国临床实验室标准化协会(Clinical Laboratory Standards Institute,CLSI)2016版及2023版中关于类鼻疽伯克霍尔德菌的敏感或耐药标准进行判定[9-10]。据CLSI 的判读标准,此分离株对头孢他啶、亚胺培南、美罗培南、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦和复方新诺明均表现敏感,未产生耐药。

2.3 基因测序结果

2.3.1 基本情况 SX22_3027BPD的基因组由连续序列组成,总长度为7 074 398 bp,GC含量为68.27%,共检测到5 808个蛋白质编码序列,编码区域占比为83.39%。

2.3.2 MLST分型分析 类鼻疽伯克霍尔德菌有ace、gltB、gmhD、lepA、lipA、narK、ndh7个管家基因的等位基因数为1～29个[11]。向MLST数据库提交全基因组序列,获得该菌株的ST型为366。该菌株与我国海南省分离的2株菌(BP2016和BP155)为相同ST型。从数据库选取自1975年至今,我国上传的309株类鼻疽伯克霍尔德菌(人源275株、环境17株及动物17株),共94个ST型,采用BN软件进行MLST聚类分析,结果见图2。

注:每个圆形代表一个ST型,圆形大小代表数量的多少。红色代表此次鉴定的ST366型菌株,紫色代表MLST型数量在10条以上,绿色代表10条以下。图2 309株类鼻疽伯克霍尔德菌的MLST最小生成树Fig.2 MLST minimum spanning tree diagram of 309 strains of Burkholderia pseudomallei

从图2可以看出在我国ST型较常见有ST46(28,9.1%)、ST58(23,7.4%)、ST70(23,7.4%)、ST50(22,7.1%)、ST55(16,5.1%)、ST32(10,3.2%)、ST37(10,3.2%)及ST1095(10,3.2%),与Fang Y等[12]研究结论一致。

该菌株的MLST分型ST366与ST51亲缘关系最近,只有lipA基因不同,其余几个基因都一致,两型均为从ST50分支进化而来,见表1。

表1 3株类鼻疽伯克霍尔德菌的MLST分型Tab.1 Multi locus sequence typing of three B. pseudomallei strains

2.3.3 耐药基因携带情况 利用Resfinde软件进行耐药基因分析发现,此菌株携带β-内酰胺类抗生素耐药基因blaOXA-59,不携带blaOXA-57,与黄静敏等对广东省分离株的耐药基因分析结果一致[13]。

2.3.4 系统发育进化关系分析 构建本研究分离株与遗传关系相近ST型代表株共54株类鼻疽菌的全基因组单核苷酸多态性系统发育关系(图3)。这些菌株分离自1976-2022年,来自中国、澳大利亚、新加坡及泰国等国家和地区,宿主包括类鼻疽病人、环境以及动物等,共34个ST型。本研究中的 54 株菌SNP总数为61 794个。从图上可见这些菌株分成3大簇,ST366共7株,我国分离株6株,美国分离株1株,红色框中可看到此次分离株SX22_3027BPD与海南的3株ST366进化关系较近,与海南BP2016的ANI相似度值为99.88%,与BP155的相似度为99.74%,与GCA_015320315的相似度为99.95%,这4株菌的亲缘关系较近,SNP总数为494个;而与美国1株从食蟹猴中分离的同为ST366的菌株进化关系较远,位于不同的分支上。

注:系统进化树从左到右的信息分别表示为菌株所在分支位置、菌株名称、登录号、MLST型、分离年份、分离地及菌株来源,左下角红色框内为聚集成簇的6株ST366型菌株进化关系放大图。图3 基于全基因组单核苷酸多态性的类鼻疽伯克霍尔德菌系统发育关系Fig.3 Phylogenetic relationship of B. pseudomallei strains based on whole genome single nucleotide polymorphisms (wgSNPs)

3 讨 论

类鼻疽伯克霍尔德菌是一种人兽共患的高致病性细菌,它主要存在于热带地区的土壤和水中[14-15],被该菌污染的泥土和水是类鼻疽的主要传染源,农民、渔民等都是其主要易感人群,另外免疫功能低下者也容易感染类鼻疽伯克霍尔德菌[7]。该病例患者在海南旅游期间有疫区环境暴露史,且曾患有紫癜性肾炎,也是引起此次感染发生的重要易感因素。

类鼻疽发病的初期,患者可出现畏寒、发热、头痛、咳嗽、咳痰、胸痛、腹痛、尿频、尿急、尿痛、骨关节疼痛等一系列非特异性表现,极易被误诊为其他疾病[16-17]。而本例患者刚开始时出现不明原因发热,并且高烧持续不退而入院,患者入院后,医生刚开始经验性使用哌拉西林/他唑巴坦治疗,病情有所好转,但停药后病情反复、加重,待血培养、细菌鉴定结果均提示可能为类鼻疽伯克霍尔德菌时,临床专家给予静脉滴注美罗培南等进行治疗[18],病情便迅速得以控制,最后患者康复出院。

本研究中采用微生物质谱仪、API 20NE生化鉴定卡两种方法同时对菌株进行种属的鉴定。微生物质谱仪的使用极大提高了临床对细菌的鉴定范围和能力,但是它也存在鉴定的缺陷,其中泰国伯克霍尔德菌与类鼻疽伯克氏菌的指纹图谱极其相似,易发生鉴定错误[19]。在此次病例的病原学诊断中,布鲁克质谱仪就出现了该菌株首次鉴定错误。任何鉴定方法均有局限性,因此在怀疑鉴定结果时,可采用多种鉴定方法同时鉴定。

类鼻疽伯克霍尔德菌可在环境中持久存在,不同地理区域的特定环境分布、疾病临床表现及发病率等方面均存在明显差异,从而导致类鼻疽病的流行病学研究变得复杂。多位点序列分型(MLST)是分子流行病学研究中重要分子分型方法,可为研究细菌的遗传多样性及流行病学关联提供证据支持。自2003年以来,MLST已广泛应用于B.pseudomallei的分子流行病学研究[11]。Fang Y等[12]对中国102株B.pseudomallei的MLST进行分析发现,我国主要的ST型为ST46(12.7%)、ST50(10.8%)、ST58 (10.8%)、ST55 (5.9%)、ST70 (8.8%) 及 ST1095 (6.9%),与本研究MLST数据相类似,当时的41个型别,目前已达到94个ST型,表明我国类鼻疽伯克霍尔德菌具有很高的遗传多样性。此次分离株的与海南3株菌的ST型相同均为ST366,ST366与ST51、ST50遗传相似度较高,而ST50为我国海南省常见的基因型[20-21]。ST型的一致性为此例海南省输入山西省病例提供了分子流行病学证据。

2004 年,Holden等[22]首次对类鼻疽伯克霍尔德菌进行了全基因组测序,揭示了类鼻疽伯克霍尔德菌的基因组特征,随后全基因组测序技术被全面运用于类鼻疽伯克霍尔德菌的研究。2017 年,Chewapreecha C等[23]通过对30 多个国家的 469 株类鼻疽伯克霍尔德菌全基因组进行研究,构建了全球类鼻疽伯克霍尔德菌系统发育关系,提示澳大利亚为该病原的源头,然后传播到东南亚的泰国、越南、马来西亚和新加坡等国家。本研究也采用了全基因测序方法进行分析,结果提示病例分离株与海南省ST366型菌株(BP2016、BP155及GCA_015320315)的同源性较高,而与美国相同ST型菌株的相似度较低,也说明与基于7 个管家基因序列的 MLST分子分型方法相比,全基因组测序技术能精确有效的追溯全球各流行地区来源的类鼻疽伯克霍尔德菌株之间的潜在流行病学联系。

近年来,随着旅游业的不断发展,世界范围内输入性类鼻疽病例的报道已屡见不鲜[24-27],已不再是单纯的热带地区流行病,它可通过疫区暴露感染而发病。这不仅给全球医疗卫生应急工作提出了新的挑战,同时也给类鼻疽诊断和研究提出了新的要求。本研究采用基因测序分析方法对分离的类鼻疽伯克霍尔德菌进行了分子溯源分析,结合流行病学调查,确定该病例为1例海南省输入性类鼻疽病例。通过对该病例的研究报道,提示医疗机构及疾控部门应加强对类鼻疽的认识,了解该菌在山西省及全国的流行情况,提高诊治和防控能力。

利益冲突：无