洋葱伯克霍尔德菌群3种鉴定方法的比较

杨丹婷 苏嘉妮 李婉珊 钟卫烨 王 曦 韦 云 丁清龙 周 露*

（广东省食品检验所 广东广州 510435）

1 前言

伯克霍尔德菌，原称为洋葱假单胞菌，由美国植物病理学家Burkholder 于1949年首次发现。它是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的革兰氏阴性细菌。随着细菌分类技术的发展，伯克霍尔德菌属包括洋葱伯克霍尔德菌群（B.cepacia complex）、假鼻疽伯克霍尔德菌（B.pseudomallei）、唐菖蒲伯克霍尔德菌（B.gladioli）、鼻疽伯克霍尔德菌（B.mallei）、泰国伯克霍尔德菌（B.thailandensis）等 60 多个菌种，具有复杂多样性，既有人畜共患病原菌，也有植物病原菌及环境分离株，临床上以洋葱伯克霍尔德菌较为常见[1,2]。洋葱伯克霍尔德菌群是基因型不同但表型相近的一组非发酵复杂菌群。2001年，Coneyet 等利用rRNA-DNA 杂交全细胞电泳和细菌表型标志物等方法将洋葱伯克霍尔德菌群分为9种基因型[3,4]。

洋葱伯克霍尔德菌群广泛存在于自然界和医院环境中，是一种常见的条件致病菌，常引起囊性纤维化疾病和慢性肉芽肿。在医学领域洋葱伯克霍尔德复合群感染已呈上升趋势，可引起多种部位的感染，可引起爆发流行，对多种抗生素具有耐药性，治疗难度大[5,6]。

在2018年度广东省食品检验所的专项抽检米面制品、淀粉及其制品专项中发现，广东省米面制品、淀粉及其制品中存在伯克霍尔德菌属污染的风险较高，特别是洋葱伯克霍尔德菌群。目前，国内的检验标准中，只有进出口口腔清洁类产品和进出口化妆品中有洋葱伯克霍尔德菌的检验标准，且鉴定的主要方法是生理生化实验[7,8]。2014年，高业成等建立了可以有效排除杂菌干扰检测出食品样品中的洋葱伯克霍尔德菌的方法[9]。2016年，胡娟等用生化实验结合PCR 方法鉴定饮水中洋葱伯克霍尔德菌[10]。在食品行业没有洋葱伯克霍尔德菌群鉴定的标准方法。因此，探究准确高效的洋葱伯克霍尔德菌群鉴定方法，可为食品标准的建立提供参考依据，提高食品安全保障。

目前，传统生化方法和临床上应用的 VITEK 2 COMPACT 不能准确区分洋葱伯克霍尔德菌群基因型[11]。VITEK MS、分子生物学手段是近年发展起来并已广泛应用于细菌鉴定的方法。本文对从广东省米面制品、淀粉及其制品中分离的洋葱伯克霍尔德菌群分别进行VITEK 2 COMPACT、VITEK MS 质谱鉴定和 16s rDNA 基因测序，其中，VITEK 2 COMPACT 只能鉴定是洋葱伯克霍尔德菌群，不能进一步细化； 16s rDNA 虽然可以鉴定出具体菌种，但由于序列相似性太高，鉴定结果不够准确； VITEK MS 质谱可直接鉴定到种水平，鉴定置信度99%，方便快捷。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

VITEK 2 Compact 自动微生物快速检测分析系统（法国生物梅里埃股份有限公司）； VITEK MS质谱仪（法国生物梅里埃股份有限公司）； Nano 核酸蛋白分析仪（日本岛津中国公司）； Gel Doc XR+凝胶成像系统（美国伯乐公司）； T100 PCR 仪（美国伯乐公司）。

脑心浸出液肉汤（BHI）（广东环凯微生物科技有限公司）； VITEK 2 COMPACT GN 鉴定卡（法国梅里埃公司）； 哥伦比亚血琼脂平板（北京陆桥技术股份有限公司）； 基质液CHCA（法国梅里埃公司）； 细菌基因组DNA 提取试剂盒（TIANamp Bacteria DNA Kit）。

实验菌株：均来源于2018年广东省米面制品、淀粉及其制品抽检样品。具体见表1。

表1 实验菌株信息

（续表1）

2.2 实验方法

用BHI 将实验需用菌株进行复苏。

2.2.1 VITEK MS 质谱仪鉴定

在48 孔靶板质控孔涂校准菌（在哥伦比亚血琼脂平板上培养24 h 新鲜的单个大肠埃希氏菌ATCC-8739 菌落），涂匀后加 1 μL 基质液 CHCA，每 16孔区域涂一个质控孔； 在样品孔涂匀待测菌，每涂一个孔加一次1 μL 基质液CHCA，待基质液干透后上机。

2.2.2 16s rDNA 基因测序

（1）DNA 提取。DNA 提取方法参照细菌基因组DNA 提取试剂盒（TIANamp Bacteria DNA Kit）操作说明进行。

（2）DNA 浓度测定。取 3.5 μL 提取的 DNA 于核酸蛋白分析仪上，以无菌水清洗、DNA 提取试剂 TE 作空白，测定 DNA 浓度。

（3）PCR。参照 PCR 试剂盒说明书。

扩增体系：DNA 模板 2 μL，上游引物（27F）2 μL，下游引物（1492R）2μL，2×PCR DSmix 25 μL，用超纯水补足至50 μL。

扩增条件：94℃，3 min； 94℃，30 s； 60℃，30 s； 72℃，2 min，30 个循环； 72℃，10 min。

（4）电泳。取 5 μL PCR 产物进行 2%琼脂糖凝胶电泳，以2 000 bp Marker 作为参照。电泳条件：120 V，40 min。电泳结束后，于凝胶成像装置成像。

（5）测序。PCR 产物由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

3 结果与分析

3.1 VITEK 2 COMPACT生化鉴定结果与分析

在VITEK 2 COMPACT 生化鉴定实验中，15 株实验菌均鉴定为洋葱伯克霍尔德菌群，只能鉴定到菌群，不能鉴定到种，可信度范围为88%～99%，可信度越接近99%，说明鉴定结果越好，详见表2。15 株实验菌在 VITEK 2 COMPACT 的 47 个生化反应中，有35 个生化实验结果完全一致； 12 个生化反应结果有区别，包括：L-脯氨酸芳氨酶、谷氨酰芳氨酶PNA、D-甘露醇、L-苹果酸盐同化、L-组氨酸同化、γ-谷氨酰转移酶、尿素酶、丙二酸盐、L-乳酸盐同化、β-丙氨酸芳氨酶 PNA、D-山梨醇、磷酸酶。其中，菌株编号为 4、5、7 的 3株菌报告的生化反应结果完全一致，具体生化反应详见表3。其中，存在差异的生化结果见表4。

表2 15株实验菌VITEK 2 COMPACT结果及可信度

表3 VITKE 2 COMPACT生化结果

表4 15株实验菌存在差异的生化结果

3.2 VITEK MS质谱鉴定结果与分析

VITEK MS 质谱实验鉴定结果可以达到种的水平。在15株实验菌中，有13株鉴定为越南伯克霍尔德菌，2株鉴定为洋葱伯克霍尔德菌。可信限为99.8%～99.99%，具体见表5。以2号和3号实验菌为例，2种菌的峰值图分别如图1和图2所示。

表5 VITEK MS鉴定结果

3.3 16s rDNA基因测序结果与分析

在16s rDNA 基因测序鉴定实验中，15 株实验菌DNA 经PCR 扩增后，获得与预期大小基本一致的1500 bp 左右的目标片段，详见图3。将测序结果在NCBI 中经过BLAST 分析比对，每个样品鉴定结果均有2 个以上，同源性均在99%以上，结果包括中心伯克霍尔德菌、洋葱伯克霍尔德菌、越南伯克霍尔德菌等，详见表6。

3.4 3种鉴定方法比较分析

3.4.1 鉴定结果比较

比较3种鉴定方法的结果，详见表7。VITEK 2 COMPACT 只能鉴定是洋葱伯克霍尔德菌群，不能进一步细化，可信度范围为88%～99%； 16s rDNA基因测序可以鉴定到种水平，序列同源性均在99%以上； VITEK MS 质谱可直接鉴定到种水平，可信限为99.8%～99.99%。

图1 越南伯克霍尔德菌峰值图（2号）

图2 洋葱伯克霍尔德菌峰值图（3号）

图3 15株实验菌16s rDNA PCR扩增结果

表6 16s rDNA基因测序结果

（续表6）

菌株编号为1 和3 的VITEK MS 结果均为洋葱伯克霍尔德菌，而16s rDNA 基因测序结果均为中心伯克霍尔德菌或伯克霍尔德菌，其余13 株菌用2种鉴定方法结果一致，VITEK MS 结果均鉴定为越南伯克霍尔德菌，16s rDNA 基因测序结果都有可能为越南伯克霍尔德菌，但不同样品用16s rDNA 基因测序方法鉴定的结果不完全一致。16s rDNA 基因测序结果不唯一的原因是，伯克霍尔德菌在16s 序列比较保守，虽然可以鉴定出具体菌种，但由于序列相似性太高，鉴定结果不够准确。2017年，黄庭轩等用RecA 序列分析得出伯克霍尔德菌属内各种鉴定有效且接近全基因组分析的结果[12]。因此，要运用分子生物学手段鉴定洋葱伯克霍尔德菌群，可先用16s rDNA 基因测序进行初筛，再进一步做RecA 基因或全基因组测序以确定具体的种类。

表7 3种鉴定方法的结果

3.4.2 鉴定时长比较

从鉴定时长比较3种鉴定方法：鉴定时长从备好上机用的增菌液或平板后开始计算，VITEK 2 COMPACT 鉴定时长相对较长，VITEK MS 最短，详见表8。

表8 3种方法的鉴定时长比较

4 结语

在3种鉴定方法中，VITEK 2 COMPACT 鉴定结果只能到洋葱伯克霍尔德菌群，鉴定时长为7 h或以上； VITEK MS质谱仪鉴定结果能到种的水平，鉴定时长只需要15 min； 16s rDNA 基因测序法鉴定能到种的水平，但由于伯克霍尔德菌在16s序列比较保守，序列比对结果不唯一，不适合鉴定到种。综上，用VITEK MS 方法鉴定洋葱伯克霍尔德菌群最佳，该方法结果准确，时效性高。