ABR产酸-硫酸盐还原相颗粒污泥富集PHAs产生菌

汪晨祥，秦永丽，蒋永荣，葛仕佳，郑国权，孙振举

（1 桂林电子科技大学生命与环境科学学院，广西 桂林 541004；2 西湖大学工学院，浙江 杭州 310030）

传统塑料具有耐化学性和热稳定性，在日常生活和工业中得到广泛应用。然而，传统塑料难以生物降解，造成一系列环境污染问题。因此寻找在物理化学性能上与传统塑料相似并能生物降解的新型材料成为研究热点[1-2]。聚羟基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates，PHAs）是一类生物合成的高分子聚酯的统称，PHAs 不仅拥有与聚乙烯、聚丙烯等石油化工产品相似的热塑性与力学性能，而且具有生物可降解性、生物相容性等特征[3]，是一种可代替传统塑料的理想材料[4]。

目前，利用纯菌发酵生产PHAs 的原料成本较高，使其工业化应用中受到限制[5-6]。与此同时，硫酸盐有机废水是亟待解决的环境污染源之一[7]。该类废水厌氧处理过程中产生大量中间产物——小分子的混合有机酸，如乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和乳酸等[8]，是PHAs产生菌合成PHAs的良好原料[9]。王爱杰等[10]的研究表明，产酸作用和硫酸盐还原作用可以同时进行，且具有显著优越性。近年来，本文作者课题组利用五隔室厌氧折流板反应器（anaerobic baffled reactor，ABR）处理硫酸盐有机废水（以蔗糖为碳源）进行了大量研究[8,11-12]。前期研究表明，在ABR 第1、第2 隔室，产酸菌（acid producing bacteria，APB）将蔗糖降解为丁酸、丙酸、乳酸和乙酸等挥发性脂肪酸（volatile fatty acids，VFAs），而硫酸盐还原菌（sulfate-reducing bacteria，SRB）则利用其中的某些VFAs（如乳酸、丙酸、丁酸等）还原硫酸盐的同时产生大量的乙酸，以作为第4、第5 隔室产甲烷菌的优良底物。上述第1、第2隔室称为产酸-硫酸盐还原相，第4、第5隔室为产甲烷相。值得注意的是，硫酸盐有机废水中的COD/SO42-比值会直接影响产酸-硫酸盐还原相微生物代谢，改变该相中VFAs 的组分和含量[13]，从而影响PHAs 产生菌的富集和PHAs 的形成[14]。目前尚未见不同COD/SO42-比值条件下产酸-硫酸盐还原相PHAs产生菌富集的相关研究。

本研究在ABR 处理硫酸盐有机废水成功启动并形成生物相分离特性的基础上，继续运行该反应器，以第1、第2隔室产酸-硫酸盐还原相颗粒污泥为研究对象，考察了进水COD/SO42-比值对颗粒污泥中PHAs产生菌合成PHAs的影响，并分析产酸-硫酸盐还原相颗粒污泥中PHAs的合成机理。

1 材料与方法

1.1 实验装置

采用的五隔室ABR总容积为77L，有效容积为62L[15]。反应器分为5 个隔室，每一隔室由上、下流室组成，上、下流室体积比为3∶1。折流板底部边缘通往上流室的折角为向上45°的导流板，便于将水送至上流室的中心，使泥水充分混合接触，维持较高的颗粒污泥浓度。反应器每个上流室上部安装了三相分离器，顶部设置导气口。反应器通过蠕动泵控制进水流量，采用保温回流管包裹反应器外壁控制反应器温度（33℃±1℃）。

1.2 实验方法

在开展本研究前已历时157 天成功启动ABR，此时进水COD 浓度为4000mg/L，进水SO42-浓度为250mg/L，COD/SO42-比值为16.0，水力停留时间（hydraulic retention time，HRT）为24h，对COD 和SO42-的平均去除率稳定在95%以上，出水VFAs 浓度低于200mg/L，颗粒污泥性能良好。此时反应器已形成良好的生物相分离特性，其中第1、第2 隔室为产酸-硫酸盐还原相。本研究在此成功启动的ABR基础上继续运行，保持COD浓度和HRT不变，通过逐渐提高进水SO42-浓度调节进水COD/SO42-比值，以考察COD/SO42-比值对产酸-硫酸盐还原相颗粒污泥中PHAs产生菌富集的影响。反应器的运行控制按照进水SO42-浓度不同分为3个阶段：第1阶段（158～215天）进水SO42-浓度为320mg/L，COD/SO42-比值为12.5；第2 阶段（216～261 天）进水SO42-浓度升高为430mg/L，COD/SO42-比值为9.3；第3 阶段（262～342 天） 进 水SO42-浓 度 升 高 为1000mg/L，COD/SO42-比值为4.0。每个阶段的运行达到稳定状态后即进入下一运行阶段。

1.3 分析项目及测定方法

1.3.1 常规指标及电镜分析

常规指标及测试方法根据《水和废水监测分析方法（第四版）》[16]以及《废水的厌氧生物处理》[17]：COD，重铬酸钾法；SO42-，重量法；VFAs含量与组分，气相色谱法[18]；颗粒污泥中PHAs 含量，气相色谱法[19]；PHAs 产生菌形态，透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）[20]

1.3.2 荧光原位杂交

颗粒污泥经固定、包埋、冷冻切片、装片脱水后进行原位杂交，杂交后洗脱，在荧光倒置显微镜下观察拍照。使用探针为：①EUB338 （5′-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′）[21]用于检测真细菌；②PHACGNF（5′-CCYRGATCAACAAGTTCTAC-3′）[22]

用于检测Ⅰ型和Ⅱ型PHAs聚合酶；③BmphaC015F（5′-CGTGCAAGAGTGGGAAAAAT-3′）[22]用于检测Ⅳ型PHAs 聚合酶，使用荧光素AMCA（蓝）对EUB338标记，荧光素Texas Red（红）对PHACGNF和BmphaC015F 标记。探针由上海生工合成制备（荧光染料接在5′端）。

2 结果与分析

2.1 反应器产酸-硫酸盐还原相的处理效能

2.1.1 不同COD/SO42-比值下COD和SO42-去除情况

随着进水SO42-浓度逐步提高，进水COD/SO42-比值由12.5 逐渐降低为9.3 和4.0，考察COD/SO42-比值的变化对反应器运行的影响。反应器第1、第2隔室的COD和SO42-平均去除率如图1所示。由图可知，随进水COD/SO42-比值的降低，第1 隔室COD 及SO42-的平均去除率有逐渐降低的趋势，进水COD/SO42-比值为12.5、9.3 和4.0 时，第1 隔室COD 的平均去除率分别为25%、24%、20%[图1(a)]，第1 隔室SO42-的平均去除率分别为91%、86%、67%[图1(b)]；而第2隔室的COD及SO42-的平均去除率明显低于第1 隔室，随进水COD/SO42-比值的降低，第2 隔室COD 平均去除率变化不大，分别为6%、6%、5%[图1(a)]，第2 隔室SO42-的平均去除率分别为6%、10%、22%，有逐渐升高趋势[图1(b)]。综上可见，随着进水COD/SO42-比值不断降低，第1 隔室的COD 和SO42-的平均去除率均逐渐降低，第2 隔室COD 的平均去除率相对稳定但SO42-的平均去除率不断上升，这种现象表明在反应器产酸-硫酸盐还原相中COD和SO42-的去除呈现沿程后移的现象。同时，第1、第2隔室总的COD 和SO42-的平均去除率均有降低的趋势，进水COD/SO42-比值为12.5、9.3和4.0时，总的COD平均去除率分别为31%、30%和26%，总的SO42-平均去除率分别是97%、96%和89%。王爱杰等[10]以糖蜜废水为碳源运行产酸脱硫反应器，在COD/SO42-比值为5.0、3.0、4.2、2.0时，COD的平均去除率在28%～33%，SO42-的平均去除率在81%～92%，其结果与本研究相似。

图1 不同进水COD/SO42-比值下COD和SO42-平均去除率

2.1.2 不同COD/SO42-比值下VFAs浓度及组分变化

不同进水COD/SO42-比值下反应器产酸-硫酸盐还原相中VFAs 浓度及组分变化情况见表1。由表可知，第1、第2隔室VFAs浓度随着进水COD/SO42-比值降低不断升高，当进水COD/SO42-比值为12.5、9.3和4.0时，第1隔室VFAs 浓度分别为1423mg/L、1631mg/L 和1848mg/L；第2 隔室VFAs 浓度分别为1289mg/L、1451mg/L和2065mg/L。

表1 不同COD/SO42-值VFAs浓度及占比

从整体看，不同COD/SO42-比值下第1和第2隔室中VFAs 组分均以乙酸和丁酸为主。与此同时，进水COD/SO42-比值的下降对乙酸、丁酸和丙酸等的占比产生了影响。当进水COD/SO42-比值由12.5降为9.3时，第1、第2隔室的VFAs组分变化不大，第1 隔室偶数碳VFAs 如乙酸和丁酸的占比分别为30%和50%左右，奇数碳VFAs 如丙酸和乳酸占比分别为15%和10%左右；第2隔室乙酸和丁酸的占比分别为70%和20%左右，丙酸占比为10%左右，乳酸未检出。然而，当进水COD/SO42-比值降为4.0时，第1、第2隔室的VFAs组分发生较大变化，第1隔室乙酸和丁酸的占比分别为22%和54%左右，丙酸和乳酸占比分别为11%和13%左右；第2隔室乙酸和丁酸的占比分别为34%和45%，丙酸占比为9%，并且在第2 隔室检测出乳酸，占比为12%。任南琪等[23]以糖蜜废水作为有机碳源运行的产酸脱硫反应器中，酸性末端产物中乙酸始终占据主导地位，占50%～82%，这种代谢类型被称为乙酸型代谢。在本研究中，随着进水COD/SO42-比值的下降，第1 隔室的代谢类型始终为丁酸型代谢；当进水COD/SO42-比值为12.5 和9.3 时，第2 隔室的代谢类型为乙酸型代谢，当比值降为4.0 时，第2 隔室逐渐转为丁酸型代谢。

2.2 不同COD/SO42-比值条件下PHAs的积累

在不同进水COD/SO42-比值条件下，产酸-硫酸盐还原相颗粒污泥中PHAs所占细胞干重的含量变化如图2 所示。由图可知，进水COD/SO42-比值为12.5时，第1、第2隔室颗粒污泥中PHAs质量分数分别为38%和19%；当进水COD/SO42-比值降为9.3时，第1、第2隔室颗粒污泥中的PHAs质量分数分别为27%和35%，由此可见第1 隔室的PHAs 含量在减少，第2隔室的PHAs含量则在增加且含量超过第1隔室；当进水COD/SO42-比值降为4.0时，第1、第2 隔室颗粒污泥中的PHAs 质量分数分别降为15%和29%。王娜等[4]利用序批式反应器以剩余污泥水解液为底物合成PHAs，反应器中PHAs 最高质量分数接近13%。Tamang等[24]以厨余废弃油脂为底物富集PHAs 产生菌合成PHAs，最高质量分数为38%。由此可见，利用硫酸盐有机废水厌氧处理的产酸-硫酸盐还原相合成PHA具有一定潜力。

图2 不同进水COD/SO42-比值颗粒污泥中的PHAs含量变化情况

综上可知，随着进水COD/SO42-比值逐渐降低，第1 隔室颗粒污泥中PHAs 的含量逐渐降低，第2隔室颗粒污泥中PHAs的含量先上升后下降，颗粒污泥PHAs 的高含量隔室由第1 隔室后移至第2 隔室。由前期研究可知，进水COD/SO42-比值的变化会影响ABR 的代谢相和系统稳定性，随着COD/SO42-比值降低，反应器产酸、硫酸盐还原、产甲烷相后移[12]，这与2.1节中第1、第2隔室的COD、SO42-去除变化和VFAs 浓度变化相符。此外，随着进水COD/SO42-比值逐渐降低，第2 隔室VFAs 中偶数碳VFAs（乙酸和丁酸）占比先升高后降低，其中乙酸占比同样先上升后降低，而奇数碳VFAs（丙酸和乳酸）占比先降低后升高（表1），有研究表明大多数天然PHAs产生菌先利用偶数碳VFAs（乙酸和丁酸），其次是奇数碳VFAs（丙酸、乳酸）[25-26]，同时乙酸驯化的活性污泥比用丙酸、丁酸驯化的活性污泥能更有效地贮存PHAs[27-28]，Jia 等[29]的研究也发现在含有3种VFAs为碳源的系统中，PHAs产生菌对VFAs的利用率为：乙酸＞丁酸＞丙酸。综上可知，在产酸-硫酸盐还原中，通过调控进水COD/SO42-比值，进而调节VFAs 的组分是富集PHAs 产生菌合成PHAs的关键。

2.3 颗粒污泥中PHAs及其产生菌形态分析

为了更清楚地了解污泥内部的微生物形态，对第215 天（COD/SO42-比 值 为12.5）、第261 天（COD/SO42-比值为9.3）、第342 天（COD/SO42-比值为4.0）时第1、第2 隔室的颗粒污泥进行TEM 观察，如图3～图5 所示。由图可见PHAs 产生菌的形态及菌体细胞内大量聚集的颗粒状PHAs，该颗粒状PHAs 与Nygaard 等[30]研究观察结果相似。进水COD/SO42-比值为12.5 时，观察到第1 隔室的PHAs产生菌细胞内存在大量颗粒状PHAs，第2 隔室中部分细胞内存在少量的颗粒状PHAs（图3）；当进水COD/SO42-比值为9.3 时，第1 隔室中存在颗粒结构的细胞数量减少，第2 隔室PHAs 产生菌个体明显变大，并且出现多种形态的细胞，细胞体内颗粒状结构显著增多（图4）；在进水COD/SO42-比值降为4.0 时，两个隔室颗粒污泥中微生物形态变小，仅有少量细胞内可以观察到PHAs颗粒结构（图5）。这与第1、第2隔室颗粒污泥中PHAs的含量变化相一致，见图2。同时，对第261天第1、第2隔室的颗粒污泥进行了FISH分析，结果如图6所示。由图可知，该阶段PHAs产生菌在颗粒污泥中广泛分布。有研究表明，PHAs 产生菌能在颗粒污泥的各个位置生长[31]，与本研究FISH观察到的现象相符。

图3 进水COD/SO42-比值为12.5时颗粒污泥TEM图

图4 进水COD/SO42-比值为9.3时颗粒污泥TEM图

图5 进水COD/SO42-比值为4.0时颗粒污泥TEM图

图6 进水COD/SO42-比值为9.3时颗粒污泥FISH图

结合2.1 节、2.2 节可知，进水COD/SO42-比值的改变影响了VFAs 组分，进而对PHAs 产生菌的数量、个体形态和颗粒状PHAs 的积累有一定影响。由表1 可知，当进水COD/SO42-比值由12.5 降至9.3，第1、第2隔室的乙酸浓度均有所上升，此时两个隔室内PHAs产生菌数量显著增多，个体形态明显变大；然而随着进水COD/SO42-比值降为4.0，第1、第2隔室中乙酸的浓度及占比较COD/SO42-比值为9.3 时有所降低，此时PHAs 产生菌形态变小，积累的颗粒结构也变少，因为一般来说相比于碳链较长的脂肪酸如丙酸、丁酸，链长较短的乙酸更有利于微生物的生长[32]。并且随着进水SO42-浓度逐渐升高，反应器内由硫酸盐还原产生的硫化物含量不断增加，对微生物产生一定毒性作用，同时SRB具有一定硫酸盐和硫化物的耐受性，可以正常生长繁殖[33]。分析认为，在产酸-硫酸盐还原相中，保持进水COD/SO42-比值在合适的范围，有助于PHAs 产生菌生长繁殖与PHAs 的积累；且PHAs 产生菌个体大、颗粒状PHAs 聚集多的污泥PHAs 含量也高。

2.4 产酸-硫酸盐还原相PHAs合成途径分析

由液相VFAs 组分及固相颗粒污泥微生物中PHAs 积累状况推测，产酸-硫酸盐还原相中存在如图7 所示的生物链式协同代谢模式。由图7 可知，硫酸盐有机废水中的蔗糖主要被水解菌和APB转化为三碳以上VFAs（乳酸、丙酸、丁酸等），这些三碳以上VFAs 可以被脂肪酸型SRB（fatty-acid utilized-SRB，FSRB）利用转化为乙酸的同时还原硫酸盐，而乙酸进一步被乙酸型SRB（acetic-acid utilized-SRB，ASRB）利用还原硫酸盐生成二氧化碳。其中APB、FSRB 和ASRB 均可利用各阶段产生的VFAs 合成PHAs，本文作者课题组[8]前期高通量测序的结果也佐证了这一点，16S rRNA高通量测序结果表明，在COD/SO42-比值为6.9时，ABR第1、第2隔室的优势菌为APB与SRB，如窄食单胞菌属（Stenotrophomonas）为APB，有研究表明其具有合成PHA的能力[34]；Widdel等[35]首次在SRB中观察到PHAs的积累，Hai等[36]发现多种SRB如脱硫球菌属（Desulfococcus）、脱硫杆菌属（Desulfobacterium）等具有利用VFAs 合成PHAs 的能力。综上，在产酸-硫酸盐还原相中，存在APB-FSRB-ASRB 生物链式协同代谢模式，其中APB、FSRB 和ASRB 可利用VFAs各组分合成PHAs并贮存于菌体内。

图7 产酸-硫酸盐还原相中PHAs合成途径

3 结论

（1）在ABR产酸-硫酸盐还原相中，进水COD/SO42-比值会影响COD 与SO42-的去除、VFAs 的浓度和组成以及反应器的代谢类型。随着进水COD/SO42-比值由12.5 降低至4.0，COD 与SO42-的去除沿程后移；反应器第1隔室保持丁酸型代谢类型，第2隔室由乙酸型代谢转为丁酸型代谢类型。

（2）通过调控进水COD/SO42-比值，进而改变液相中VFAs 的组分，是产酸-硫酸盐还原相中富集PHAs产生菌和提高PHAs 产量的关键。随着COD/SO42-比值降低，颗粒污泥PHAs含量由第1隔室高于第2隔室转变为第2 隔室明显高于第1 隔室，其中COD/SO42-比值9.3 时，产酸-硫酸盐还原相颗粒污泥PHAs 合成效果最好。TEM 和FISH 观察结果表明，颗粒污泥中PHAs 含量较高时，PHAs 产生菌大量富集，细胞体内颗粒状PHAs数量较多。

（3）在ABR反应器产酸-硫酸盐还原相中，存在APB-FSRB-ASRB的生物链式协同代谢模式，同时APB、FSRB 和ASRB 利用多种VFAs 合成并积累PHAs于菌体内。