超高效液相色谱-串联质谱结合化学计量学分析金银花中多组分含量

钱桂英 钱云英 吴晓明 金凤珠

摘要：建立超高效液相色譜-串联质谱同时测定金银花中9种主要成分的方法。采用负离子扫描方式，对主要成分进行化学计量学分析。色谱分离采用 Thermo Hypersil GOLD 色谱柱，柱温35 ℃。流动相由甲醇和 0.2% 甲酸水溶液组成，结合聚类热图分析和主成分分析对金银花进行综合分析。结果表明： 9个化合物峰面积与浓度之间具有良好的线性关系（R2>0.999 1），日内精密度（0.96%～2.26%）、日间精密度（0.52%～3.04%）和稳定性（0.85%～2.15%）均符合相对标准偏差；回收率在96.77%～101.94%之间，相对标准偏差在2.48%～4.01%之间；层次聚类分析和主成分分析在内的化学计量学结果表明，不同地区的金银花活性成分含量存在明显差异，3-O-咖啡酰奎宁酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸为贡献最大的化合物。该研究可为进一步开展金银花有效成分及相关量效关系、相关产品的质量控制提供参考。

关键词：金银花；超高效液相色谱-串联质谱；化学计量学；多成分；含量测定

中图分类号：R284.1   文献标志码：A   文章编号：1002-4026（2023）05-0001-08

Analysis of the contents of active ingredients in Lonicerae japonicae flos based on UPLC-MS/MS combined with chemometrics

QIAN Guiying， QIAN Yunying， WU Xiaoming， JIN Fengzhu*

（Changshu Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine， Changshu 215500， China）

Abstract∶This study aimed to devise a methodology for the simultaneous determination of the contents of nine primary components in Lonicerae japonicae flos through ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. The chemometric analysis of the nine primary components was performed via negative ion scanning. Further， chromatographic separation was performed on a Thermo Hypersil GOLD column at a temperature of 35 ℃. The mobile phase comprised methanol and water containing 0.2% formic acid， as determined through the cluster thermogram and principal component analyses of Lonicerae japonicae flos. The peak areas with concentrations of nine components exhibited a good linear relationship （R2>0.999 1）， and the intraday （0.96%～2.26%） and interday （0.52%～3.04%） precisions and stability values （0.85%～2.15%） agreed well with relative standard deviation （RSD）. The recovery rate was between 96.77% and 101.94%， and the RSD was between 2.48% and 4.01%. The results of the chemometric， hierarchical cluster， and principal component analyses revealed that there were considerable differences in the contents of the active ingredients of Lonicerae Japonicae Flos from various regions， and 3-O-caffeoylquinic acid and 3，5-dicaffeoylquinic acid were considered as the dominant compounds. UPLC-MS/MS quantitative and chemometric analyses of Lonicerae Japonicae Flos performed herein may provide a reference for the modernization of and innovative research on the effective ingredients of Lonicerae Japonicae Flos and related quantity effect relations as well as the quality control of related products.

Key words∶Lonicerae japonicae flos; UPLC-MS/MS; chemometrics; multicomponent; assay

金银花是忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb. 的干燥花蕾或带初开的花，原产于中国，大约1 500 年前，在现今的河南等地大量种植[1]，常用于治疗痈肿疔疮、咽喉麻木、丹毒、血毒毒痢、风热感冒、温热等。现代药理研究表明，金银花具有抗炎、抗氧化、保肝、细胞保护、抗菌、抗糖尿病和抗乙型肝炎病毒等活性，化学成分为黄酮类、环烯醚萜类、三萜皂苷、生物碱等[2-4]。目前，金银花种植区主要集中在山东、山西、河南、河北、湖北、江西、广东等地，由于地理条件、气候等原因，每个产地的金银花主要有效成分的含量存在差异，功效也会有所不同[5-7]。金银花中发挥抗菌和抗炎作用的主要成分是黄酮类和酚酸类物质，2020版《中国药典》中还规定了其指标成分为3-O-咖啡酰奎宁酸和木犀草素[8]。因此，有必要以酚酸类和黄酮类物质为指标，对金银花进行质量控制。目前，高效液相色谱（HPLC）为测定中药成分含量的常用手段。随着超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）的出现，其高选择性、高灵敏度使中药定量分析技术更加成熟并得到广泛应用[9-12]。金银花目前的质量控制研究重点在其化学成分的种类和含量，控制技术主要有HPLC法、UPLC法、UPLC-MS联用、一测多评等；除了在有效成分的含量上控制，有害成分如重金属和农药残留等控制标准均有报道[13-14]。在本文中，建立了 UPLC-MS/MS 方法测定来自 10 个不同地区的金银花的有效成分含量，在负离子扫描模式下，测定了9种抗菌消炎的主要成分，对 10 批样品进行了化学计量学分析，以期为金银花的有效成分及相关量效关系、相关产品的质量控制提供参考依据。

1 仪器与材料

UPLC-TSQ QUANTIS三重四极杆质谱系统（Thermo Scientific），JA203H型十万分之一电子天平（常州市幸运电子设备有限公司），KQ3200DE型数控超声波清洗器（青岛精诚仪器仪表有限公司），DZKW-C型水浴锅（河南沃林仪器设备有限公司）。

HPLC级甲醇（Fisher Scientific），HPLC 级甲酸（Sigma），蒸馏水（杭州娃哈哈集团）。所有其他试剂均为分析纯。10批次的金银花信息见表1。所有样品由南京中医药大学常熟附属医院主任中药师金凤珠鉴定为金银花正品。3，4-二羟基苯甲酸（批号SH-211102）、5-O-咖啡酰奎宁酸（批号SH-211021）、3-O-咖啡酰奎宁酸（批号SH-220321）、4-O-咖啡酰奎宁酸（批号SH-220122）购自上海源叶生物科技有限公司。咖啡酸（批号110885-201703）、3，5-二咖啡酰奎宁酸（批号111782-202208）、木犀草苷（批号111720-202111）、芦丁（批号100080-202012）、4，5-二咖啡酰奎宁酸（批号111894-202205）、标准品酸和内标氯霉素（批号130303-202115）购自中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备

金银花粉末过60目筛，取粉末0.05 g，加入10 mL甲醇， 35 Hz超声提取30 min。然后将样品以5 000 r/min[JP]離心15 min，取上清液，0.22 μm滤膜过滤，4 ℃冰箱保存备用。

2.2 对照品溶液制备

9种标准品适量溶解于甲醇中制备储备液（质量浓度均为 1.00 mg/mL）。

2.3 分析条件

色谱条件：采用Thermo Hypersil GOLD 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），柱温35 ℃。流动相由甲醇（A）和0.2%甲酸水（B）组成。梯度洗脱：0～6 min，90%～83% B；6～7min，83%～60% B；7～12 min，60%～50% B；12～13 min，50%～90% B；13～15 min，90% B。流速为0.3 mL/min，进样体积为2 μL。

质谱条件：所有样品均在负离子模式下进行分析。分析方法采用多反应监测的选择性反应模式（MRM）。优化参数设置如下：鞘气30 kPa；辅助气10 kPa；吹气：0 kPa，离子传输管温度325 ℃，蒸发器温度350 ℃，各组分监测条件见表2。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性考察

取供试品溶液、混合对照品溶液适量，按2.3项下色谱和质谱条件进样分析，负离子模式下采集数据。根据离子对，样品与对照品的保留时间，质谱信息保持一致，待测成分分离效果良好，无干扰，结果见图1。

2.4.2 线性关系考察

精密吸取混合对照品母液溶液，用溶剂稀释至不同浓度后依次进行分析，记录峰面积，以峰面积 （Y） 为纵坐标，进样浓度 （X） 为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表3。

2.4.3 精密度试验

取同一份混合对照品溶液，1 d内连续进样6 次，记录峰面积，测得日内精密度3，4-二羟基苯甲酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、3-O-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、芦丁及4，5-二咖啡酰奎宁酸相对标准偏差δRSD分别为1.79%、1.92%、2.13%、0.96%、1.93%、2.26%、1.93%、1.60%、1.92%；每天进样3次，连续进样3 d，测定日间精密度δRSD分别为0.85%、1.10%、2.12%、1.37%、0.52%、0.63%、1.29%、1.66%、3.04%。表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验

取样品（S1）按2.1项下方法制备供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、8、12、24 h 进行测定，3，4-二羟基苯甲酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、3-O-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、芦丁及4，5-二咖啡酰奎宁酸峰面积的δRSD分别为0.85%、0.90%、1.32%、0.97%、2.15%、0.98%、0.96%、1.30%、1.74%，表明样品在24 h内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验

取样品（S1），按2.1项下方法平行制备6份供试品溶液，以2.3项下色谱条件进行测定，得3，4-二羟基苯甲酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、3-O-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、芦丁及4，5-二咖啡酰奎宁酸的平均含量分别为20.12 μg/g（δRSD=2.26%）、2 431.45 μg/g（δRSD=3.21%）、22 146.58 μg/g（δRSD= 2.71%）、34.03 μg/g（δRSD=2.57%）、878.64 μg/g（δRSD=2.62%）、1 347.08 μg/g（δRSD= 2.39%）、68.49 μg/g（δRSD= 2.76%）、69.42 μg/g（δRSD=3.32%）及2 212.44 μg/g（δRSD=2.31%），表明重复性良好。

2.4.6 加标回收率试验

精密称取已知含量样品（S1）0.05 g，共6 份，按100%的量各加入3，4-二羟基苯甲酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、3-O-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、芦丁及4，5-二咖啡酰奎宁酸对照品的混合溶液，按2.1项下方法制备供试品溶液，按2.4项下色谱条件进行测定，计算加样回收率，得3，4-二羟基苯甲酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、3-O-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、芦丁及4，5-二咖啡酰奎宁酸平均回收率在96.77%～101.94%，δRSD在2.48%～4.01%（均低于5.0%），表明方法的准确度符合要求，结果见OSID科学数据与内容附表1。

2.5 样品含量测定

取10批样品，按2.1项下方法制备供试品溶液，按2.3项下条件进行分析，计算含量，结果见表4。

2.6 统计学分析

以9个化合物为指标成分进行聚类分析和热图分析，结果如图2所示。结果显示10批次样品被分成许多簇，说明即使是同一种中药，其含量在不同产地之间也存在较大差异。在热图中，可以观察到3-O-咖啡酰奎宁酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸是样品的主要成分。

主成分分析如图3所示，S7和S9样品与其他批次样品存在显着差异，这与定量分析中S7类黄酮含量较高和S9酚酸含量较高的结果一致。此外，3-O-咖啡酰奎宁酸的贡献率为97%，3，5-二咖啡酰奎宁酸的贡献率为2%，3-O-咖啡酰奎宁酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸的累计贡献率达到99%，表明3-O-咖啡酰奎宁酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸是金银花的主要成分，此结果与热图的结果一致。

3 讨论与结论

为了获得高质量分数的样品溶液，我们进行了提取优化试验。首先，研究了9种化合物在不同溶剂中的提取效率，以最大限度地提高化合物的质量分数。用4种不同比例的甲醇溶液（甲醇体积分数分别为100%、85%、70%、50%）和4种不同比例的乙醇溶液（乙醇体积分数分别为100%、85%、70%、50%）超声提取60 min。发现100%甲醇作为溶剂时，9种成分的提取效率最好。其次，为了获得更好的提取效果，考察了提取时间对9种化合物提取效率的影响，进行超声提取30、45、60、90 min，发现提取时间对结果没有显著差异，因此，选择30 min的最短提取时间。此外，我们选择了 Thermo Hypersil GOLD 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）和 Waters Acquity UHPLC HSS T3 色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）。在相同柱温、流动相和梯度洗脱条件下，Thermo Hypersil GOLD 色谱柱具有更好的分离效果、更好的峰形和更短的保留时间。因此，我们选择了 Thermo Hypersil GOLD 色谱柱进行分离。

在本研究中，建立了一种 UPLC-MS/MS 方法，用于快速同时测定金银花中的 9 种化合物。经验证该方法具有良好的精密度、准确度、重复性和稳定性。以9个化合物为指标成分进行聚类分析和热图分析，结果显示10批次样品被分成许多簇，说明即使是同一种中藥，其含量在不同产地之间也存在较大差异。在热图中，可以观察到3-O-咖啡酰奎宁酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸是样品的主要成分。化学计量学结果表明，金银花的区域差异很大，9种化合物中3-O-咖啡酰奎宁酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸的累计贡献率达到99%。综上所述，UPLC-MS/MS结合化学计量学是一种简单有效的控制金银花品质的方法，该研究为金银花的可持续发展奠定了理论基础，为中药的综合开发利用提供了技术思路。

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