结直肠癌组织Tregs占比和Foxp3、IL-10、TGF-β1 mRNA表达变化及其意义

马虎林，孙晓霞，陈良全，张浩，党利敏

1 内蒙古自治区人民医院腹部肿瘤外科，呼和浩特 010010；2 内蒙古自治区人民医院外科门诊；3 内蒙古医科大学内蒙古临床学院

结直肠癌（CRC）是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的主要原因之一［1］。CRC 在早期大多无明显临床症状，肿瘤确诊率较低，多数患者确诊时已属中晚期。CRC 的发生发展及免疫逃逸机理仍不明确，对于丧失手术时机的CRC 患者仍缺乏有效的治疗方法。调节性T 细胞（Tregs）是机体内重要的免疫抑制细胞，可抑制CD8+CTL 细胞、自然杀伤细胞及树突状细胞（DC）等多种免疫效应细胞的功能，在肿瘤免疫逃逸机制中具有关键作用。Tregs 通常是指CD4+CD25+Foxp3+T细胞，是继K-ras 后对CRC 预后判断具有潜在意义的分子标记物之一，可能成为一项CRC 的独立预后评估指标［2］。白细胞介素10（IL-10）和转化生长因子β1（TGF-β1）是参与免疫调节及具有免疫抑制功能的细胞因子，而Treg细胞可通过释放IL-10和TGF-β等抑制性细胞因子参与维持对机体免疫平衡［3-4］。叉头转录因子（Foxp3）是Tregs最关键的细胞内标志物，对于Tregs的分化和功能维持具有重要作用。大量研究［5-7］证实，外周循环、区域淋巴结和恶性肿瘤患者肿瘤部位（包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌和皮肤癌）的Tregs 均会增加。CRC 患者正常结肠黏膜中Foxp3+Treg 密度高与预后较差相关［8-10］。因此，探讨Tregs 在CRC 中的可能作用，在CRC 的靶向治疗中具有重要意义。本研究观察了CRC 组织中调节性T细胞（Tregs）占比及Foxp3、IL-10、TGF-β1mRNA 表达情况，分析了Tregs 占比与CRC 临床病理参数的关系，旨在探讨Tregs 发挥免疫逃逸的可能机制，为CRC的治疗提供一个新的思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2021 年6 月—2022 年6 月内蒙古自治区人民医院收治的CRC 患者24 例，男16例，女8 例；年龄<60 岁10 例，≥60 岁14 例；TNM 分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期6例，Ⅲ期11例，Ⅳ期4例；回盲部肿瘤1例，升结肠肿瘤4例，横结肠肿瘤3例，降结肠肿瘤5 例，乙状结肠肿瘤11 例；肿瘤直径：<5 cm 13例，≥5 cm 11 例；组织学分级：中高分化17 例，低分化7 例。所有患者术前均经病理学检查确诊，且均未行化疗或放疗。选取手术切除的CRC 组织及正常结肠组织各24 例份。本研究经内蒙古自治区人民医院伦理委员会批准，并获得所有患者的书面知情同意。

1.2 主要试剂及仪器 MACS CD4MicroBeads、MACS 分选器、MACS-Octo 解离器均购自于德国Miltenyi Biotec 公司；TRIzol 液购自于Invitrogen 公司；RNA 提取试剂盒购自于德国Qiagen 公司；Super‑script Ⅱ逆转录试剂盒购自于Miltenyi 公司；FITC 标记鼠抗人CD4单克隆抗体、PE 标记鼠抗人CD25单克隆抗体、PE 标记鼠抗人FOXP3 单克隆抗体购自于Pharmingen 公司；胎牛血清、RPMI 1640 培养基购自于美国Gibco 公司；FASC Calibur 流式细胞仪购自于美国BD 公司；荧光定量PCR 仪购自于美国Corbett公司。

1.3 CRC 组织中Tregs 占比测算 ①单核细胞分离：将CRC 组织和正常结肠组织样本切碎，并研磨为悬糊状，在含2.5%胎牛血清（FBS）和1 mmol/L二硫苏糖醇的汉克斯缓冲盐水溶液（HBSS）中孵育20 min，然后在37 ℃、0.75 mmol/L EDTA 中孵育3周期，每次15 min，分别去除粘液和上皮细胞。将样品转移到含有钙和镁的gentle MACS C 管（Miltenyi）中，加入0.5 mg/mL 胶原酶Ⅳ（Sigma 公司）、50 ng/mL DNAse Ⅰ（Thermo Fisher）、2%胎牛血清和10%胎牛血清。拧紧C 管盖子，倒置在带加热器的gentle-MACS Octo 解离器（Miltenyi）上进行组织解离。用滤器去除分离的组织块，并用HBSS 液冲洗滤器，收集过滤液，室温下以300 g离心10 min，弃去上清，用冰HBSS 重悬细胞。②CD4+T 细胞分选：采用免疫磁珠法。在重悬的单核细胞中加入PBS洗涤一次，以1 500 r/min速度离心5 min，弃去上清；取约1×107细胞加入80 μL 缓冲液重悬细胞，加入20 μL的MACS CD4+MicroBeads，混匀，4 ℃条件下放置20 min；转移至15 mL 离心管中，加入4 mL 的PBS 缓冲液，充分混匀，以1 500 r/min速度离心时间5 min；弃离心上清，用500 μL 的PBS 缓冲液重悬细胞，使用吸管缓慢反复吹打10次，使细胞能够均匀分散开同时磁珠不脱离细胞；将分离柱置于MACS 分选器中，加入3 mL 的PBS 缓冲液冲洗分离柱，然后将细胞悬液缓慢加入到分离柱中，进行分选；将分离柱移出磁场，用5 mL 的PBS 缓冲液反复冲洗分离柱，收集冲洗液，微量离心机离心5 min（2 500 r/min），弃上清溶液，并用500 μL 的PBS 缓冲液重悬所有细胞，-70 ℃冻存备用。此部分即为CD4+T 细胞。③Tregs 占比测算：取CD4+T 细胞，计数，调整细胞悬液浓度为1×107/mL，取样100 μL 加入离心管，封口，4 ℃孵育20 min；分别加入10 μL 的CD25、10 μL 的CD4和10 μL 的Foxp3 抗体，涡旋振荡4～5 s，充分混匀，封口，4 ℃低温避光孵育15 min；加新配制的溶血素2 mL（按1︰9 的比例配置溶血素，1 mL 的10×溶血素 + 9 mL 的双蒸水）后避光孵育10～15 min，根据红细胞裂解状态，以1 500 r/min 速度离心5 min；弃去上清，用PBS 缓冲液洗涤1 次，再加入200～500 μL 的PBS 液混匀，封口，避光4 ℃保存，上流式细胞仪检测。对照管按同样测定条件上机检测。结果分析用Flow Jo 软件。根据散点图分布选定淋巴细胞群，再以CD4+T 细胞和SSC 设门，选择CD4+T 细胞分析门内相关Tregs 的比例。Tregs 占比以CD4+T细胞中被标记为CD4+CD25+Foxp3+的细胞所占百分比表示。

1.4 CRC组织中Tregs相关因子检测 采用实时定量PCR法。取CRC组织和正常结肠组织，液氮冷冻后研磨成粉，TRIzol提取组织总RNA，用SuperScript Ⅱ逆转录试剂盒合成cDNA，按照PCR 试剂盒说明书进行扩增，引物设计及合成由TAKRA 公司完成，Foxp3 上游引物5′-GAGAAGCTGAGTGCCATGCA-3′，下游引物5′-AGAGCCCTTGTCGGATGAT-3′；IL-10 上游引物5′-CGAGATGCCTTCAGCAGAGTG-3′，下游引物5′-TCATCTCAGAACAAGGCTTGGC-3′；TGF-β1上游引物5′-GGCAGTGGTTGAGCCGTGGA-3′，下游引物5′-TGTTGGACAGCTGCTCCACCT-3′；GAPDH 上游引物5′-AAGAGCTACGAGCTGCCT‑GAC-3′，下游引物5′-ATGGCCCAGCGGATGAG-3′。反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共45 个循环。以GAPDH 为内参，采用2−ΔΔCt法计算Foxp3、IL-10、TGF-β1mRNA的相对表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用配对t检验；计数资料比较采用χ2检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRC 组织和正常结肠组织Tregs 占比比较 CRC 组织和正常结肠组织Tregs 占比分别为4.23% ± 0.74%、7.73% ± 2.04%，两者比较，P<0.05。

2.2 CRC组织和正常结肠组织Foxp3、IL-10、TGF-β1相对表达量比较 CRC 组织和正常结肠组织Foxp3相对表达量分别为4.05 ± 1.27、1.35 ± 0.53，IL-10相对表达量分别为3.52 ± 0.98、1.4 ± 0.31，TGF-β1相对表达量分别为0.96 ± 0.24、0.78 ± 0.25，两者比较，P均<0.05。

2.3 Tregs占比与CRC临床病理参数的关系 Tregs占比与CRC 临床病理参数的关系见表1，由表1 可知，Tregs占比与CRC肿瘤分期相关（P<0.05）

表1 Tregs占比与CRC临床病理参数的关系（± s）

表1 Tregs占比与CRC临床病理参数的关系（± s）

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3 讨论

CRC 是世界上最常见的致命恶性肿瘤之一，全球每年有1 000多万人罹患结、直肠癌［11］。在世界范围内，我国CRC 的发病率低于西方发达国家，但目前总体呈上升趋势。我国CRC 发病率已升至恶性肿瘤的第三位，在一些发达城市病死率甚至已升至第二位［12-13］。目前CRC 的治疗方法以多种治疗手段联合的综合治疗模式为主，虽然为患者带来了一定的生存获益，但5 年生存率仍徘徊在50%～60%，总体治疗效果不尽如人意［14］。因此，寻找理想的CRC早期诊断和预后评价指标以及理想的治疗靶点十分必要。

Tregs 是一种具有免疫抑制性的T 淋巴细胞亚群，被认为是参与肿瘤免疫耐受的主要细胞群。在肿瘤免疫逃逸过程中，Tregs通过细胞间的直接接触和分泌细胞因子（如TGF-β1、IL-10 等）的方式，抑制CD4+T细胞、CD8+T细胞、DC和NK细胞的功能活性，从而降低机体免疫应答的效力，达到免疫抑制的作用，使肿瘤细胞发生免疫逃逸［15］。研究［16-17］表明，Foxp3 是Tregs 中的特异性标志物，其表达水平对于Tregs 的成熟发育和免疫抑制作用的发挥具有重要意义。Foxp3 作为转录因子，可通过调节多种与肿瘤发生具有直接或者间接关系的肿瘤基因表达来发挥对肿瘤的免疫抑制作用，如Foxp3 可抑制LAST2、p21、BRCA 等常见的抑癌基因的表达。Foxp3 也可通过激活Wnt/β-catenin 信号通路和上皮—间质细胞转化（EMT）促使肿瘤生长［18］。IL-10 主要通过抑制抗原提呈细胞（APCs）对抗原的递呈从而抑制机体对肿瘤免疫监视作用。如抑制DC、Th17 细胞的活性，减少IL-23、IL-17 的分泌，进而促进肿瘤的发生发展［19］。TGF-β1不仅能刺激血管生成和免疫逃避，而且可通过刺激癌细胞的EMT 过程，进而促进肿瘤生长。此外，TGF-β1还可通过对癌基因的激活或肿瘤抑制因子丢失而减轻免疫系统对肿瘤细胞的抑制作用。如TGF-β1通过介导PSPC1 等因子的表达，从而促进肿瘤进展［20］。Tregs 在CRC、肝癌、卵巢癌及前列腺癌等多种肿瘤患者外周血和肿瘤局部微环境中表达增高，且Tregs水平与患者肿瘤进展及预后呈负相关；在肿瘤切除后Tregs 可恢复到正常水平，而肿瘤复发时Tregs增多，而且这些Tregs表达的Foxp3 水平也较高，说明Tregs 与肿瘤的侵袭性和预后密切相关［21］。对于CRC 患者，外周血、肿瘤引流区域淋巴结、肿瘤部位Tregs会增多，这些Tregs可以主动迁移到免疫活性部位［5，22］。研究［11］发现，CRC组织与正常CRC组织相比FOXP3过表达，FOXP3的表达与Dukes 分期及淋巴结转移呈正相关。因此，Tregs 和Foxp3 在CRC 的发生、发展和治疗中具有重要的作用，可能成为治疗靶点和预后评估的指标。本研究显示，相比正常结肠组织，肿瘤浸润组织中Tregs 明显增多，且与肿瘤的TNM 分期呈正相关，同时肿瘤组织中Foxp3、IL-10、TGF-β1mRNA 表达升高，这与之前的许多研究结果一致，证实Foxp3+通过基因转录水平下调促炎性因子的表达，如TNF-p、IL-2、GM-CSF 等，并上调免疫抑制因子的表达，如IL-10、TGF-β1以及血红素加氧酶等，从而发挥免疫抑制的功能。这些研究表明，Foxp3 具有特异性地表达Tregs 的作用，因此Foxp3 可作为Tregs 的一个特异性标志物。从另一个角度来看，我们可以利用检测Foxp3 的水平来评估Tregs 在实验标本中的表达水平，进而评估其免疫抑制功能的强弱。

总之，CRC 组织中Tregs 占比增加，Tregs 占比与患者肿瘤分期有关，Foxp3、IL-10、TGF-β1在CRC 组织中呈高表达。