颈动脉粥样硬化斑块患者外周血LCAT基因启动子区DNA甲基化情况观察

赵佳，姜小建，谢紫阳，屈晓艳，左林

1 西安市中心医院检验科，西安 710003；2 空军军医大学唐都医院放射科

由动脉粥样硬化所导致的心脑血管疾病已成为当今严重危害人类生命健康的疾病之一。颈动脉粥样硬化斑块是一种常见的动脉粥样硬化表现形式，其临床特点是颈动脉内膜下脂质沉积和纤维组织增生，导致血管腔狭窄和血流受限。脂代谢异常是其重要发病机制。卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）催化血浆脂蛋白中游离胆固醇的酯化，在高密度脂蛋白（HDL）代谢和胆固醇的逆向转运过程中发挥关键作用［1-2］。LCAT 异常可影响胆固醇的逆向转运，进而促进动脉粥样硬化的发生和发展［3］。DNA 甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，甲基化通常发生在基因启动子区，抑制基因转录，这种变化可以通过细胞分化遗传。研究［4］显示，动脉粥样硬化患者可以通过DNA 甲基化调控脂代谢相关基因的表达，影响其功能，与动脉粥样硬化的形成密切相关。本研究观察了颈动脉粥样硬化斑块患者外周血LCAT基因启动子区DNA 甲基化情况，并分析甲基化占比与颈动脉狭窄程度的关系，以期为动脉粥样硬化的发病机制和临床治疗提供新的理论和实验依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2020年6—12月西安市中心医院收治的颈动脉粥样硬化斑块患者52例（观察组），男33 例，女19 例；年龄50～64（57.06 ± 4.42）岁；BMI（25.10 ± 3.46）kg/m2；TC（4.42 ± 0.97）mmol/L；TG（1.76 ± 0.75）mmol/L；HDL-C（1.07 ± 0.23）mmol/L；LDL-C（2.62 ± 0.89）mmol/L；SBP（134.65 ±20.86）mmHg；DBP（80.24 ± 12.79）mmHg；FBG（6.11 ± 2.13）mmol/L；有吸烟史19 例（36.54%）。纳入标准：①符合《中国头颈部动脉粥样硬化诊治共识》的诊断标准［5］；②年龄<65岁；③受试对象知情同意并表示愿意配合。排除标准：①严重感染性疾病；②恶性肿瘤；③血液和免疫系统疾病；④严重肝肾功能不全；⑤颅内出血和占位性病变；⑥近期服用降血脂类药物。另选同期无颈动脉粥样硬化斑块健康体检者50 例（对照组），男30 例，女20 例；年龄50～62（55.64 ± 4.26）岁；BMI（23.76 ± 3.73）kg/m2；TC（4.15 ± 0.88）mmol/L；TG（1.44 ± 0.54）mmol/L；HDL-C（1.16 ± 0.30）mmol/L；LDL-C（2.37 ±0.76）mmol/L；SBP（131.52 ± 18.34）mmHg；DBP（78.46 ± 11.32）mmHg；FBG（5.75 ± 1.94）mmol/L；有吸烟史11 例（22.00%）。两组一般资料无统计学差异，具有可比性。本研究经医院伦理委员会通过，且患者知情同意。

1.2 外周血LCAT 基因启动子区DNA 甲基化情况观察 采集所有受试者空腹肘静脉血2 mL，应用血液基因组DNA 抽提试剂盒提取外周血基因组DNA，严格按照说明书进行操作。提取的DNA 进行1%琼脂糖凝胶电泳，并检测其浓度和纯度。-80 ℃冰箱保存备用。在NCBI GenBank 数据库中查询LCAT（GenBank ID： 3931）基因序列，应用MethPrimer 甲基化预测软件（http：//www. urogene. org/methprim‑er/）对LCAT 基因启动子区进行甲基化预测。经预测存在3 个甲基化区域，分别设计3 对引物，引物序列：区域1，上游引物GAGGGTTATAGATTGGTGGT‑TAGT，下游引物CAAAAACATAAACATACCAC‑CATC；区域2，上游引物AGTTGGGTTTTTAYGGT‑TAATTTTG， 下 游 引 物 CACCTTACCTC‑CRAAAAATAAACAC；区域3，上游引物ATGGTT‑TATGGYGATTTGTGATT，下 游 引 物 CTCAC‑TATTCCTAAATAAACCAAACA。以提取的外周血基因组DNA 作为模板，进行PCR 反应，扩增3 个甲基化区域基因片段。PCR 反应条件为：95 ℃预变性3～5 min；94 ℃变性30 s；55～60 ℃退火25～30 s；72 ℃延伸30～50 s，35 个循环。反应后的PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的基因，与pUCm-T Vector 连接，连接产物转化感受态细胞（SK9307），进行蓝白斑筛选，提取质粒，应用硫化测序PCR（BSP）方法对甲基化位点进行测序。DNA 甲基化判定标准：用亚硫酸氢盐处理DNA，未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不会转变。随后在PCR 扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，然后对PCR 产物进行测序，再与DNA 原始序列比对来判定CpG位点是否发生甲基化。

1.3 颈动脉狭窄程度检查 对观察组进行头颈部CTA 检查，根据《中国头颈部动脉粥样硬化诊治共识》对血管进行狭窄程度进行判定，轻中度狭窄为血管狭窄程度<70%，重度狭窄为血管狭窄程度>70%及血管闭塞［5］。

1.4 统计学方法 采用SPSS23.0 统计软件。计数资料比较采用χ2检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

观察组外周血LCAT基因启动子区DNA 甲基化占比为65.38%（34/52），对照组外周血LCAT 基因启动子区DNA 甲基化占比为36.00%（18/50），两组甲基化占比比较，P<0.05。观察组34例甲基化患者中，颈动脉轻中度狭窄21 例（61.8%）、重度及闭塞13 例（38.2%）；观察组18 例非甲基化患者中，颈动脉轻中度狭窄16 例（88.9%）、重度及闭塞2 例（11.1%）；两者轻中度狭窄、重度及闭塞占比比较，P均<0.05。观察组甲基化患者和非甲基化患者典型病例CTA图像见图1。

图1 观察组甲基化患者和非甲基化患者典型病例CTA图像

3 讨论

颈动脉粥样硬化斑块是一种动脉粥样硬化病变，通常呈现为黄色或黄棕色斑块，质地较硬，贴附在颈动脉内膜下，形成脂质斑块和纤维斑块，它主要由胆固醇、脂质和钙盐组成，随着时间的推移，这些斑块会逐渐增厚并脱落［6］。颈动脉粥样硬化斑块的形成和发展会引起局部血流动力学的改变。斑块的存在会使得颈动脉内膜变得不规则，增加了血流阻力。同时斑块的脱落可能会导致血栓形成，进一步阻塞血流［7］。颈动脉粥样硬化斑块的存在增加了脑卒中和心脏病等心血管事件的风险［8］。颈动脉粥样硬化斑块的临床表现可以因患者的个体差异而有所不同，但一般包括以下几个方面：首先，颈动脉听诊时可能会发现异常的血流声音，如血流湍流声、颈动脉杂音等。这些异常声音可能是由于颈动脉粥样硬化斑块引起的血流不畅所致［9］。其次，颈动脉粥样硬化斑块的存在会导致颈动脉血流减少甚至完全中断，使得颈动脉搏动减弱或消失。医生可以通过触摸颈动脉来评估患者的颈动脉搏动情况［10］。此外，颈动脉粥样硬化斑块可能导致脑供血不足，引起一系列脑血管症状，如头晕、头痛、视力模糊、言语困难、肢体无力等，严重的情况下，还可能出现突发性面瘫、短暂性偏瘫等症状。最后，颈动脉粥样硬化斑块的并发症还可能包括心血管症状，如胸痛、心悸、呼吸困难等。这是由于斑块脱落导致血流阻塞心脏供血的冠状动脉所致。

LCAT 基因位于人类染色体16q22.1 上，包含6个外显子和5 个内含子，全长约为4 200 bp，编码胆固醇逆向转运过程中的关键酶LCAT。LCAT 在体内的主要功能是催化游离胆固醇与磷脂结合，形成胆固醇酯。这个过程在胆固醇代谢中起着重要作用，对于维持胆固醇平衡至关重要。LCAT 基因的甲基化是指DNA 中的甲基化修饰发生在LCAT基因上。甲基化是一种常见的表观遗传修饰方式，不涉及DNA 序列的变化［11］。这种修饰是通过DNA 甲基转移酶将甲基基团转移到DNA 分子上的胞嘧啶碱基上实现的。在LCAT 基因上，甲基化通常发生在CpG 位点上，这是DNA 序列中的一种特殊序列，其中的C 碱基与紧邻的G 碱基通过磷酸二酯键连接。CpG 位点的甲基化状态可以影响基因的表达，从而影响相关的生物过程和疾病的发生［12］。研究［13-14］发现，DNA 异常甲基化在炎症反应、内皮损伤、泡沫细胞形成和平滑肌细胞增殖等过程中起着重要作用。此外，脂代谢相关基因的DNA 甲基化在动脉粥样硬化的发生和发展过程中也发挥了一定的调控作用［15-16］。然而，LCAT 基因的甲基化与动脉粥样硬化之间的关系尚不明确。本研究显示，观察组LCAT基因启动子区DNA 甲基化占比高于对照组，此结果与陈久凯等［17］的研究结果一致。本研究还发现，观察组甲基化者颈动脉狭窄程度明显高于非甲基化者。结果表明，LCAT 基因甲基化可能影响胆固醇代谢和胆固醇平衡的维持，与动脉粥样硬化的发生和发展密切相关。考虑到动脉粥样硬化的发生和发展与脂代谢紊乱密切相关，LCAT 基因的甲基化可能是动脉粥样硬化发生的一个重要机制。近年来，许多学者采用颈动脉超声检查评估颈动脉狭窄情况［18］。颈动脉血管超声诊断具有成本较低、简单无创的特点，不仅可以动态检测血流动力学情况，还能评估血管内膜损伤情况。然而受颅骨的影响，超声无法全面评估颈内动脉全段及颅内血管的狭窄情况，存在一定的局限性［19］。因此，本研究采用256 排CT 血管成像评估动脉粥样硬化患者头颈部血管狭窄程度，不受颅骨的干扰，能够准确、全面地显示颈内动脉、颈外动脉、颈总动脉及椎动脉全段异常部位的狭窄程度和斑块形态，从而使结果更加准确、全面。

总之，动脉粥样硬化患者外周血LCAT 基因启动子区DNA 甲基化与动脉粥样硬化斑块的形成密切相关，可能是促进动脉粥样硬化的发生和发展重要影响因素。至于LCAT 基因甲基化是否通过影响LCAT 的生物学功能而导致脂代谢紊乱，我们将在后续研究中进一步探讨。需要注意的是，LCAT 基因与动脉粥样硬化以及动脉狭窄的关系是复杂的，受到多种遗传和环境因素的影响。因此，在临床实践中，应综合考虑多个因素，包括基因、生活方式、环境等，来评估患者的动脉粥样硬化风险和狭窄程度。