非肌层浸润膀胱癌患者癌组织BLACAT2、WDR5表达观察及预后影响因素分析

石艳宏，何丹，马晓燕，董兵卫，郭文文，高应芳，司小敏

1 咸阳市中心医院病理科，陕西咸阳 712000；2 西安市中心医院病理科；3 咸阳市中心医院肿瘤科

膀胱癌是常见的泌尿外科恶性肿瘤，全世界每年新发病例达43.0 万，死亡例数达16.5 万［1］。膀胱癌以非肌层浸润膀胱癌（NMIBC）最为常见，约占所有初发膀胱肿瘤的70%。NMIBC 的治疗包括经尿道膀胱肿瘤电切、术后膀胱局部灌注化疗等，但仍会发生肿瘤局部复发或远处转移的现象，导致不良预后［2］。因此，有必要深入研究膀胱癌疾病机制，寻找能够评估膀胱癌预后的肿瘤标志物。长链非编码RNA 膀胱癌相关转录本2（BLACAT2）是一种长链非编码RNA，又称为LNC00958，长度为2.6 kb。BLACAT2 在膀胱癌［3］、食管癌［4］等恶性肿瘤中表达上调，通过促进肿瘤细胞上皮间质转化，促进肿瘤增殖及转移，是新的肿瘤标志物。WD 重复域蛋白5（WDR5）属于WD 重复蛋白家族成员，具有典型的WD 重复序列，该序列有助于异源三聚体或多蛋白复合物的形成，参与包括细胞周期进展、信号转导、细胞凋亡和基因调控等多种细胞过程［5］。胃癌、结肠癌中WDR5 的表达升高能够通过组蛋白H3 赖氨酸4（H3K4）三甲基化，促进细胞周期素D1的表达，促进肿瘤细胞的恶性增殖［6-7］。目前，BLACAT2 和WDR5在NMIBC中的表达尚不清楚，鉴于既往研究中BLACAT2、WDR5的肿瘤促进作用，两者可能是新的NMIBC 肿瘤标志物，影响NMIBC 患者的无进展生存预后。本研究观察了NMIBC患者癌组织BLACAT2、WDR5表达变化，并分析患者预后的影响因素。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018 年2 月—2019 年2 月咸阳市中心医院收治的NMIBC 患者94 例，男55 例，女39 例；年龄38～69（62.52 ± 4.26）岁；<60 岁40 例，≥60 岁54 例；有吸烟史41 例，无吸烟史53 例；肿瘤直径≥3 cm 者25例，<3 cm 者69例；肿瘤数目为单发67例，多发27 例；肿瘤TNM 分期为Ta/Tis 期43 例，T1期51例；病理分级为低级别54例，高级别40例。纳入标准：①所有患者均接受经尿道膀胱肿瘤电切术，经术后病理诊断为非肌层浸润膀胱尿路上皮癌；②首次诊治，术前均未接受放化疗等抗肿瘤治疗；③患者及家属对本研究知情同意并签字，临床和随访资料完整。排除标准：①合并其他器官恶性肿瘤；②合并尿道狭窄，尿路感染或严重肝肾功能障碍等；③妊娠哺乳期妇女。留取经尿道膀胱肿瘤电切术切除的NMIBC 和正常膀胱黏膜组织各94 例份。本研究经伦理委员会审核批准。

1.2 NMIBC 和正常膀胱黏膜组织BLACAT2、WDR5 mRNA 检测 取NMIBC 和正常膀胱黏膜组织，液氮中研磨，TRIzol 法提取组织总RNA，微量分光光度计检测OD260/OD280 比值介于1.8～2.1。将总RNA反转录为cDNA后进行实时荧光定量聚合酶链反应。引物由上海华大公司设计合成。BLA‑CAT2 正向序列：5'-AGCAGCGAAAACGTGGTTGTA-3'，反向序列：5'-GCCGCAAAATAGTGTGCAAAG-3'；WDR5 mRNA 正向序列：5'-TTTTGCGGCTTC‑GAGTAACCA-3'，反向序列：5'-GGCCTTGTA‑AGGTTGTGCCA-3'；GAPDH 正向序列：5'-ACTCGT‑GTCATCAGCGACTTG-3'，反向序列：5'-GCAACAG‑TAGGTTTCCTTGTGT-3'。反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，变性退火延伸共40 个循环。总体系20 μL，包括SYBR Premix Master Mix 10 μL，正反向游引物各1 μL，cDNA 1 μL 和双蒸水 7 μL。以GAPDH 为内参，BLACAT2、WDR5 mRNA 相对表达量采用2-ΔΔCt法表示。

1.3 NMIBC 和正常膀胱黏膜组织WDR5 蛋白检测 取NMIBC 和正常膀胱黏膜组织，以10%中性甲醛固定后，常规石蜡包埋切片，切片厚度4 μm，常规进行免疫组化染色。WDR5兔单克隆抗体购于英国Abcam公司（货号ab178410）。梯度酒精脱水后中性树脂封片。切片置于倒置显微镜下观察染色情况。根据染色深度评分与染色面积评分的乘积进行评分，染色深度评分：无染色0 分，浅黄色1 分，棕黄色2 分，棕褐色3 分；染色面积评分：阳性面积<25%计1 分，25%～50%计2 分，51%～75%计3 分，>75%计4分。乘积≥2分为阳性，<2分为阴性。

1.4 NMIBC 患者随访方法 所有患者术后接受规范的膀胱灌注化疗。术后第1 年每3 个月电话或门诊随访1次，术后第2～3年每半年随访1次，随访内容为肿瘤复发进展及患者生存情况，随访方式为膀胱镜镜检，尿脱落细胞及盆腔CT 等影像学检查等。随访终点为2022 年3 月1 日。进展定义肿瘤膀胱局部复发，盆腔或远处转移或发生肿瘤相关死亡。无进展生存时间（PFS）定义为自确诊之日至肿瘤复发，转移或肿瘤相关死亡时间发生的间隔时间。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。符合正态性分布的计量资料以±s表示，组间比较采用两独立样本t检验。计数资料比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson 相关分析法。生存分析采用Kaplan-Meier 分析，Log-rank 检验比较生存曲线间的差异。单因素及多因素Cox 回归分析影响膀胱癌患者无进展生存预后的因素。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NMIBC 和正常膀胱黏膜组织BLACAT2、WDR5 mRNA及WDR5蛋白相对表达量比较 NMIBC组织BLACAT2、WDR5 mRNA 相对表达量分别为2.19 ± 0.38、1.62 ± 0.41，正常膀胱黏膜组织分别为0.47 ± 0.09、0.61 ± 0.12，两者比较，P均<0.05。NMIBC、正常膀胱黏膜组织WDR5 蛋白阳性率分别为71.28%、10.64%，P<0.05。

2.2 NMIBC 组织BLACAT2、WDR5 mRNA 表达的相关性 NMIBC 组织BLACAT2 mRNA 与WDR 5 mRNA表达呈显著正相关（r=0.756，P=0.000）。

2.3 BLACAT2、WDR5 mRNA 表达与NMIBC 临床病理特征的关系 BLACAT2、WDR5 mRNA 表达与NMIBC 临床病理特征的关系见表1，由表1 可知，BLACAT2、WDR5 mRNA 表达与NMIBC 肿瘤分期、病理分级有关（P均<0.05）。

表1 BLACAT2、WDR5 mRNA表达与NMIBC临床病理特征的关系（± s）

表1 BLACAT2、WDR5 mRNA表达与NMIBC临床病理特征的关系（± s）

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2.4 不同BLACAT2、WDR5 mRNA 表达的NMIBC患者总体无进展生存率比较 分别根据癌组织BLACAT2、WDR5 mRNA 表达的平均值2.19、1.62为界，分为BLACAT2高表达者（n=50）和低表达者（n=44），WDR5 mRNA高表达者（n=48）和低表达者（n=46）。BLACAT2 高表达者、低表达者3 年总体无进展生存率分别为44.00%（22/50）、77.27%（34/44），WDR5 mRNA 高表达者、低表达者3 年总体无进展生存率分别为41.67%（20/48）、78.26%（36/46），两者比较，P均<0.05。

2.5 NMIBC 患者生存影响因素 以随访过程中NMIBC患者的是否发生肿瘤进展为因变量（1=进展，0=未进展，t=无进展生存时间），纳入年龄（≥60岁vs.<60岁）、性别（男vs.女）、吸烟史（有vs.无）、病理分级（高级别vs.低级别）、肿瘤直径（≥3 cmvs.<3 cm）、肿瘤数量（多发vs.单发）、肿瘤分期（T1期vs.Ta/Tis期）、BLACAT2（高表达vs.低表达）、WDR5 mRNA（高表达vs.低表达）为自变量，将单因素分析中差异具有统计学意义的因素（P<0.05）纳入多因素Cox回归分析，结果显示肿瘤分期T1期、肿瘤分级高级别、BLA‑CAT2高表达、WDR5 mRNA高表达是影响NMIBC患者无进展生存预后的独立危险因素，详见表2～3。

表2 NMIBC患者无进展生存预后的单因素Cox回归分析结果

表3 NMIBC患者无进展生存预后的多因素Cox回归分析结果

3 讨论

膀胱癌是常见的尿路恶性肿瘤，每年新发患者例数达8.2 万［8］。NMIBC 是临床最常见的膀胱癌类型，肿瘤分期包括Ta、T1、Tis 期。NMIBC 的临床治疗以经尿道膀胱肿瘤电切术为主，辅以术后膀胱灌注化疗，但术后仍有约60%患者发生肿瘤局部复发，约15%患者进展为肌层浸润膀胱癌，导致不良预后［9］。目前，NMIBC 预后的评估主要根据肿瘤分期，病理分级等因素进行危险分层，但由于肿瘤异质性，仍然难以准确评估患者临床预后［10］。深入研究膀胱癌发生发展的机制，寻找有效评估膀胱癌预后的分子标志物，对于指导临床治疗，改善高危患者的临床预后意义重大。

BLACAT2 基因位于11p15.3，是一种长链非编码RNA。近年来发现，BLACAT2 作为一种致癌因子，其表达升高促进肿瘤细胞的恶性增殖、转移，是新的肿瘤治疗靶点［11］。组蛋白甲基化修饰是组蛋白在组蛋白甲基转移酶的作用下其氨基酸残基甲基化过程，参与多种真核生物转录激活过程。WDR5 是WD-40 蛋白家族成员，具有甘氨酸—组氨酸及色氨酸—天冬氨酸支架结构，能与H3K4 甲基化位点结合，参与胚胎干细胞分化，发育等生物学过程。近年来发现，WDR5通过参与形成蛋白复合体，在表观遗传学水平转录激活下游基因表达，参与胃癌等恶性肿瘤的发生发展［12］。

本研究显示，NMIBC 组织BLACAT2 表达升高，此结果与SEITZ 等［13］研究结果一致。SEITZ 等［13］利用二代测序对膀胱癌中差异性表达的长链非编码RNA 进行分析，证实癌组织BLACAT2 表达上调较为显著，但该研究纳入的病例主要以Ta 期为主，本研究增加Tis 和T1 期病例，能够更为客观反映非肌层浸润膀胱癌中BLACAT2 的表达情况。本研究还显示，BLACAT2 表达与NMIBC 肿瘤分期、病理分级有关，提示BLACAT2 参与促进膀胱癌的肿瘤进展。分析其机制，BLACAT2 能够促进膀胱癌侵袭和转移。XIAO 等［14］发现，膀胱癌中BLACAT2 的表达升高，其通过抑制c-Jun 氨基末端激酶通路，促进膀胱癌细胞的增殖和上皮间质转化，促进肿瘤的侵袭能力。HE 等［15］报道，BLACAT2 的表达上调能够诱导血管内皮生长因子C的表达，促进膀胱癌淋巴转移，动物实验中予以抗血管内皮生长因子C抗体则能够逆转BLACAT2过表达引起的膀胱癌转移。因此，膀胱癌中BLACAT2表达升高参与肿瘤的发生发展，可能是评估膀胱癌患者不良预后的肿瘤标志物。本研究证实，BLACAT2 高表达的NMIBC 患者无进展生存预后较差，是影响患者无进展生存预后的独立危险因素，表明BLACAT2 有助于评估NMIBC 患者的临床预后。分析其原因，一方面是BLACAT2高表达患者肿瘤恶性程度高，术后复发转移的风险较大。另一方面，REN 等［16］发现，BLACAT2 高表达的肿瘤细胞对5 氟尿嘧啶等化疗药具有较强的耐药性，从而增加了患者术后肿瘤复发的风险。

本研究显示，NMIBC 组织WDR5 mRNA 和蛋白表达均明显升高，此结果与国内学者利用基因芯片研究结果一致［17］。HUANG 等［18］报道，膀胱癌中热休克因子1 能够与蛋白精氨酸甲基转移酶5 相互作用，招募并激活WDR5 的表达，促进H3K4 三甲基化，导致淋巴增强子结合因子1、基质金属肽酶9 和E2F 转录因子2 的表达上调，促进膀胱癌的侵袭和淋巴转移能力。本研究还显示，WDR5 mRN 表达与NMIBC肿瘤分期及病理分级有关，提示WDR5促进膀胱癌的肿瘤进展。分析其机制，可能是WDR5的表达影响肿瘤微环境中免疫细胞的浸润。LU 等报道，WDR5的表达升高能够通过H3K4三甲基化，上调胰腺癌肿瘤细胞骨桥蛋白水平及程序性死亡配体1的表达，促进肿瘤细胞免疫逃逸。本研究中，WDR5 mRNA高表达是影响膀胱癌患者无进展生存预后的独立因素，表明WDR5 是一种新的NMIBC 预后相关肿瘤标志物。分析其原因，NMIBC经尿道膀胱肿瘤电切后肿瘤可发生复发，复发高峰在术后半年和一年半，这与术中存在肉眼难以分辨的微小病灶或肿瘤残余有关，而术后膀胱灌注化疗对减少肿瘤复发发挥重要作用。本研究中WDR5 mRNA高表达患者术后易发生肿瘤复发进展，这可能是WDR5 mRNA高表达肿瘤细胞存在化疗耐药的现象。ZHANG 等报道，膀胱癌肿瘤细胞T24、UM-UC-3 中过表达WDR5 能够增强对顺铂化疗药物的耐药性，而加用WDR5 的特异性抑制剂OICR-9429 后，提高了肿瘤对化疗治疗的敏感性。因此，临床医生可根据NMIBC 组织WDR5 的表达，对患者电切术后的预后进行评估，对于高危复发的患者予以积极治疗及随访，以改善患者临床预后。本文结果还显示，BLACAT2 mRNA 与WDR5 mRNA表达呈正相关，提示NMIBC 中BLACAT2 与WDR5可能存在协同的作用关系，共同参与膀胱癌的肿瘤进展。HE 等在膀胱癌细胞系和小鼠模型中证实，BLACAT2的过度表达通过与人H3K4甲基转移酶复合物的核心亚基WDR5 直接相互作用，表观遗传学上调血管内皮生长因子-C 的表达，促进膀胱癌相关的淋巴管生成和淋巴转移［10］。但两者能否成为新的治疗靶点，值得临床深入研究。

总之，NMIBC 组织BLACAT2、WDR5 表达升高，与肿瘤分期、病理分级及无进展生存预后有关，是潜在的评估NMIBC 患者无进展生存预后的肿瘤标志物，肿瘤分期T1 期、肿瘤分级高级别、BLACAT2 高表达、WDR5 mRNA 高表达是影响NMIBC 患者无进展生存预后的独立危险因素。