miR-1306-5p在AML患者骨髓组织单个核细胞中的表达及对HL60细胞增殖凋亡和迁移侵袭调控作用观察

伍燕平，王蒙，张平平，朱凯，袁媛，李佳佳

蚌埠医学院第一附属医院血液科，安徽蚌埠 233003

急性髓系白血病（AML）是常见的血液系统恶性肿瘤，特征为骨髓中未成熟髓系造血细胞异常增殖和分化［1-2］。AML 的发病率为3.7/100 000，病死率为2.7～18/100 000［3-4］。HL60是人原髓细胞白血病细胞，多用于AML 的功能实验研究［5］。尽管过去几十年对AML 的研究不断深入提高了对该病的认识与理解，但其发病机制尚未完全阐明。因此，阐明AML发生发展的基础机制，有助于改善AML的治疗效果。微小RNA（miRNA）是一类小的非编码RNA，在转录后水平上调节基因表达，已被确定为正常和恶性生物过程中的主要调节因子［3］。在AML 中，miRNA 的失调与造血前体的不同分化阶段有关，因此miRNA 的作用在于造血和肿瘤发生具有重要作用［6］。近年研究［7-9］发现，微小RNA-1306-5p（miR-1306-5p）在多种肿瘤中低表达并发挥抑癌作用，但目前其在AML 发生发展中的具体作用机制尚不明确。2021 年6—12 月，我们观察了miR-1306-5p 在AML 患者骨髓组织单个核细胞中的表达，以及对HL60 细胞增殖凋亡和迁移侵袭调控作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂 HL60细胞（无锡怀信生物公司）。RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、SYBR Green试剂盒（Thermo Fisher公司），CCK8检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒（Abcam 公司），Transwell（Corning 公司），RI-PA细胞裂液（Boster公司），1%青链霉素10%胎牛血清（Gibco公司），质粒（上海 Genepharma 公司）。miR-1306-5p mimics sense：5′-CCACCUCCCCUGCA AACGUCCA-3’，miR-1306-5p mimics antisense：5′-UG‑GACGUUUGCAGGGGAGGUGG-3′；miR-1306-5p in‑hibitor：5′-UGGACGUUUGCAGGGGAGGUGG-3′；U6 sense：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6 antisense：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-1306-5p reverse primer：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC AATTCAGTTGAGTGGACGTT-3′，miR-1306-5p sense：5′-AATACCACCT CCCCTGCA-3′。

1.2 骨髓组织单个核细胞miR-1306-5p 检测 取2021 年6—12 月收治的AML 患者和再生障碍性贫血（AA）患者的骨髓血标本各2 mL。该研究方案经蚌埠医学院第一附属医院伦理委员会签署批准，所有参与者均获得知情同意，所有受试者均同意并同意本研究。将AA和AML患者的骨髓血标本各2 mL分别置于EDTa_K2 管中，用红细胞裂解液提取单个核细胞。用TRIzol 提取总RNA，后取RNA 样品1 μL，使用超微量分光光度计SMA1000 测量总RNA的纯度与浓度，并收集浓度在30～70 ng/μL 之间且OD260/280 比值在1.8～2.0 之间总RNA 样本。按照miRNA 逆转录试剂盒（MR101-01/01/02，南京诺唯赞生物公司）说明书逆转录出cDNA，在PCR 仪上扩增特定DNA 片段（单样本均设置3 个复孔进行对照）计算其均值，AML 患者与AA 患者均以U6 作为内参基因采用一体化miRNA RT-qPCR 检测试剂盒（Q711-02，南京诺唯赞生物公司）检测。逆转录体系10 μL，反应条件如下：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃保存。PCR 反应阶段体系20 μL，循环条件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，循环次数40 次。采用2-ΔΔCt法计算miR-1306-5p相对表达水平。

1.3 HL60 细胞培养、分组、过表达和敲低miR-1306-5p质粒转染效率检测 将HL60细胞放在加入1%青链霉素、10%胎牛血清的DEME 培养基中，并置于37 ℃含有5%CO2的细胞箱中培养，每隔24 h进行传代。取生长良好的HL60细胞接种于6孔板，1×105/孔，当细胞生长至70%以上融合时进行后续转染。将HL60细胞各分为1、2、3、4组。1组为过表达对照组，转染mimic control；2 组为miR-1306-5p 过表达组，转染miR-1306-5p mimics；3 组为敲低对照组，转染Inhibitor control；4 组为miR-1306-5p 敲低组，转染miR-1306-5p inhibitor。使用Lipofectamine™ 2000（美国Invitrogen）转染试剂盒，所有操作均严格按照说明书进行。转染后将各组细胞置于37 ℃培养箱中继续培养48 h。转染48 h 取各组细胞，RT-PCR法检测各组miR-1306-5p，确定miR-1306-5p 转染效率。1、2、3、4 组miR-1306-5p 相对表达量分别为3.55 ± 0.40、5.64 ± 0.28、3.65 ± 0.29、1.64 ±0.17，2 组较1 组miR-1306-5p 相对表达量增高，4 组较3 组miR-1306-5p 相对表达量降低（P均<0.05），提示miR-1306-5p质粒转染成功。

1.4 转染过表达和敲低miR-1306-5p 质粒的HL60细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。将各组HL60细胞（2×103/孔）接种于96孔板中。使用RPMI1640培养基（含10%胎牛血清）进行孵育。转染48 h 后，每个孔加入10 μL 的CCK-8 试剂，37 ℃孵育3 h。测定酶标仪在450 nm 吸光度时的光密度OD 值。以OD 值代表各组细胞的增殖活力，每组实验重复3次，取平均值。

1.5 转染过表达和敲低miR-1306-5p 质粒的HL60细胞凋亡能力检测 采用流式细胞仪。转染48 h后的各组HL60 细胞用预冷的PBS 重悬，用PI（5 μL，50 μg/mL）和Annexin V-FITC（10 μL）染色。避光室温孵育15 min，采用流式细胞仪进行检测各组细胞的凋亡率。实验重复3次，取平均值。细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.6 转染过表达和敲低miR-1306-5p 质粒的HL60细胞迁移、侵袭能力检测 采用Transwell 法。侵袭能力，将100 μL 的Matrigel 胶均匀地铺在Transwell小室，在培养箱中聚合成薄膜。调整HL60 细胞浓度为2×105/mL，上室中加入细胞悬液200 μL，下室中加入600 μL 含有10%胎牛血清的培养基。24 h后取出上室用多聚甲醇固定30 min，PBS 清洗两次，结晶紫染色10 min，PBS 液漂净，用棉签擦去未侵袭细胞，干燥后观察，随机选取5 个低倍镜视野（×100），计算平均数后以代表细胞的侵袭能力。迁移能力，无需在Transwell 小室中加入Matrigel 胶其余同侵袭步骤。

1.7 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AML 患者和AA 患者miR-1306-5p 相对表达量比较 AML 患者和AA 患者miR-1306-5p 相对表达量分别为0.27 ± 0.07、1.00 ± 0.08，两者比较，P<0.05。

2.2 各组细胞OD 值、细胞凋亡率、迁移细胞数、侵袭细胞数比较 细胞OD 值、细胞凋亡率、迁移细胞数、侵袭细胞数比较见表1。

表1 各组细胞OD值、细胞凋亡率、迁移细胞数、侵袭细胞数比较（± s）

表1 各组细胞OD值、细胞凋亡率、迁移细胞数、侵袭细胞数比较（± s）

注：与mimics control组比较，*P<0.05；与inhibitor control组比较，#P<0.05。

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3 讨论

AML 是血液系统常见的高度异质性的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的重要原因。其特征主要表现为髓系祖细胞的增殖失控，使未成熟的前体细胞在骨髓中异常聚集，从而引起正常成熟血细胞生成不足［10］。尽管近年来随着临床和实验室诊断方法不断完善，使AML 的治疗有了显著改善，但是AML 的预后仍然很差，5 年生存率仍低至30%［11］。AML 仍是癌症相关死亡的重要原因，AML 发病机制复杂多样，尚未完全阐明，因此在此研究我们选择AML 原髓细胞株HL60，设计miR-1306-5p 过表达和敲低质粒转染HL60 细胞株，为AML 潜在的发病机制进行阐明及研究，以期改善AML 的治疗效果，提高患者生存率。

越来越多的证据表明，一些miRNAs 参与了AML的发生与发展，使其成为AML治疗的治疗靶点和潜在的诊断生物标志物［12］。然而，miRNAs 在AML 进展中的确切功能仍未得到充分的研究。miRNA 是一系列小的非编码RNA，在转录后或翻译水平的上调控基因表达［4，13］。miRNAs 在人体中具有非常强大的调节功能，调控范围很广，其与肿瘤的重要相关性已被大量研究证实。它在细胞分化、增殖和凋亡等各种生物过程中起着重要的作用。越来越多的证据表明，miRNAs 是AML 的关键调控因子［4，6］。DEBERNARDI 等［14］通过对HOX 家族基因的初步研究的文献综述，检测到5 个可调控HOX 家族基因的特异性miRNA。在随后的研究中，BRYANT等［15］发现，在伴有NPM1 突变的AML 患者中，miR-10a 的表达异常高。下调MiR-10a 可促进AML 细胞的凋亡。研究人员发现，miR-10a 通过抑制两个下游靶基因KLF4 和RB1CC1 来抵抗细胞凋亡。随着先进的检测技术，AML 的miRNA 表达谱将不断提高。miRNAs 将在AML 的发生和发展的诊断中发挥新的作用，为AML 的诊断和靶向治疗提供新的思路。miR-1306-5p 涉及多种疾病以及肿瘤的发病机制，在多种不同类型的肿瘤组织或细胞中与其对应相关对的正常对照标本中，miR-1306-5p的表达量均表现出具有差异，并且差异均具有统计学意义。CHEN 等［12］研究发现，miR-1306-5p 可以通过靶向BIK 从而降低脑缺血/再灌注损伤。有研究［16］表明，miR-1306-5p 可以通过调控人釉质母细胞瘤细胞系AM-1 细胞中与釉质生成不全症相关的基因来调节成釉细胞分化。此外DANG 等［17］研究发现，lncRNA AC007207.2 可以通过miR-1306-5p/SIRT7 轴促进骨肉瘤细胞的增殖和转移，并且还发现miR-1306-5p发挥着骨肉瘤细胞恶性行为的作用，并抑制骨肉瘤细胞的恶性行为。一项研究［18-19］表明，miR-1306-5p在阿尔兹海默病患者中的表达明显降低，其在阿尔兹海默病发展中起到保护作用。据报道，miRNAs通过调控几个不同的靶基因，具有重要的生物学功能［16-17］。WANG 等［7］的研究中发现，过表达miR-1306-5p 时，PI3K/AKT/mTOR 信号通路被抑制，miR-1306-5p 与SLCO2A1 之间存在间接的相关性，表明SLCO2A1 是miR-1306-5p 的靶点。文献［8］报道，在胰腺导管腺癌（PDAC）中还发现miR-1306-5p的另外一个靶基因ADP-核糖基化因子（Arf）样蛋白4C（ARL4C）。其他研究显示，ARL4C 在胰腺导管腺癌中呈高表达。ARL4C 在PDAC 细胞中的表达受到miR-1306-5p 的负调节，miR-1306-5p 是ARL4C 的上游调控基因，抑制ARL4C 的翻译，从而阻碍ARL4C 的表达，抑制肿瘤的增殖、迁移和侵袭，促进凋亡［8］。在GAO 等［20］的研究中发现，在AML 细胞中下调miR-1306-5p 与细胞增殖减少和凋亡率增加相关，并且此过程通过miR-1306-5p 直接调节PHF6 的表达发挥作用。从以上的研究成果我们可以看出，miR-1306-5p 在多种肿瘤包括AML的发生和发展中调控着肿瘤组织和细胞的生物学功能。

本研究显示，与AA 患者比较，AML 患者miR-1306-5p 相对表达量低；与mimics control 组比较，miR-1306-5p mimics 组OD 值、侵袭细胞数、迁移细胞数降低，凋亡率升高；与inhibitor control 组比较，miR-1306-5p inhibitor 组OD 值、侵袭细胞数、迁移细胞数升高，凋亡率降低。提示AML 患者骨髓组织单个核细胞miR-1306-5p 表达降低，转染过表达miR-1306-5p质粒的HL60细胞增殖、迁移、侵袭能力减弱及凋亡能力增强，敲低miR-1306-5p 质粒的HL60 细胞增殖、迁移、侵袭能力增强及凋亡能力减弱。

综上所述，本研究通过干扰AML 细胞中miRNA-1306-5p的表达水平，去探索miRNA-1306-5p与AML 的关系。研究结果发现，miRNA-1306-5p 的变化能影响AML 细胞的生物学特性。因此我们有理由认为，miRNA-1306-5p 可能AML 在内的肿瘤的发病机制相关，并且有可能成为AML 的预后评估指标之一，但是在miR-1306-5p 涉及对AML 细胞生物学功能的影响，还需进一步研究。