EGCG单用/与CAR-T疗法联合应用对Raji细胞杀伤、THP-1细胞炎症因子mRNA表达抑制作用

史甲儒，姜淇耀，罗志强，2，于国华，王建勋，3

1 北京中医药大学生命科学学院，北京 102488；2 中国中医科学院中药资源中心道地药材国家重点实验室；3 深圳北京中医药大学研究院细胞与基因治疗研究所

Burkitt's 淋巴瘤是一种高侵袭性的B 细胞淋巴瘤，其增殖能力强，且临床进展迅速［1］，治疗手段主要以化疗为主。但临床上仍有部分难治性Burkitt's淋巴瘤出现，目前暂无有效的治疗方案［2］。Raji 细胞即淋巴瘤细胞，是第一个人类造血系统的连续传代细胞，为B 细胞起源，源自一位11 岁黑人男孩的左上颌骨的Burkitt's 淋巴瘤。嵌合抗原受体T 细胞疗法（CAR-T 疗法）是将自体或异体T 细胞在体外通过基因工程改造，经过体外扩增后回输患者体内，达到精准、高效杀伤肿瘤细胞的效果［3-5］。CAR-T 疗法已广泛应用于临床恶性血液肿瘤治疗，但仍然存在一些缺陷，包括细胞因子释放综合征（CRS）、神经毒性综合征等不良反应，患者血清炎症蛋白和细胞因子水平升高，且会因体内持续时间不足而导致肿瘤复发［6-11］。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是绿茶中含量最高的多酚类物质，具有抗氧化应激、抑制炎症、神经保护等功效［12-13］。近年来，EGCG 的抗肿瘤活性逐渐被重视，它可以通过影响细胞周期和细胞凋亡途径的信号分子，来遏制肿瘤的产生和发展，并且可以增强其他抗肿瘤药物的活性，逆转肿瘤耐药性，降低肿瘤复发率［14］。本研究观察了EGCG 辅助CAR-T 疗法对Raji 细胞杀伤作用，以及炎症因子表达抑制的作用，旨在为提高CAR-T 疗法的治疗效果提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株及药物 Raji 细胞（人Burkitt's 淋巴瘤细胞）来源于美国模式菌种收集中心（ATCC），CAR-T由本实验室人员自己制备。均于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中无菌培养。本研究获得北京中医药医学与实验动物伦理委员会审理与批准，审批号为2022BZYLL0102。EGCG（上海源叶生物科技有限公司，批号：C07J8Y39406）。

1.2 主要试剂及仪器 RPMI1640 细胞培养基、AIMV 细胞培养基、澳洲胎牛血清、磷酸缓冲盐（PBS）溶液、青霉素—链霉素（P/S）混合双抗溶液、台盼蓝（Gibco 公司）；OKT3 单克隆抗体、白介素2 蛋白（义翘神州）；无水乙醇（北京伊诺凯科技有限公司）；PE Mouse Anti-Human c-Myc 抗体（Invitrogen）；羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯（CFSE）；淋巴细胞分离液（Stemcell）；PrestoBlue™细胞活力检测试剂（赛默飞世尔科技公司）；RNA 提取试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；Annexin V（金普来）；Evo M-MLV 反转录试剂盒（艾科瑞生物工程有限公司）；Taq Pro Universal SYBR qPCR 预混液（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；CytoFLEX 流式细胞仪（贝克曼库尔特公司）；超微量紫外分光光度计、自动细胞计数仪（赛默飞世尔科技公司）；多功能酶标仪（Molecular Devices 公司）；小型台式高速冷冻离心机、台式高速冷冻离心机（艾本德公司）；细胞培养箱（艺思高）。

1.3 EGCG 对CAR-T 活力、耗竭的影响观察 ①CAR-T 活力：采用PrestoBlue 法。取对数生长期的CAR-T，按4×104个/200 μL 接种于96 孔板，共4 组，每组6 个复孔，将EGCG 溶液稀释至不同浓度并加入各组细胞中，每孔20 μL，使其终浓度分别为0 μmol/L（对照组）、10 μmol/L（低剂量组）、50 μmol/L（中剂量组）、100 μmol/L（高剂量组）。将细胞放入37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h，后取出96 孔板，每孔加入10 μL 的Presto Blue 试剂，再将细胞放入细胞培养箱中。30 min 后，将96 孔板取出，使用多功能酶标仪检测，设置激发波长560 nm，发射波长为590 nm，读取各孔的荧光强度（FI 值）。按照以下公式计算细胞活力：细胞相对活力（%）=FI样品/FI 对照×100%。 ②CAR-T 耗竭：将100 μmol/mL 的EGCG 处理CAR-T 24 h（EGCG 组），对照组为未处理的CAR-T，分别提取两组细胞的总RNA，并通过反转录收获cDNA，使用实时荧光定量PCR 仪进行定量PCR 反应，用2-ΔΔCT方法计算ID-3、TOX mRNA 相对表达量，以评价CAR-T 耗竭，其表达下调标志者CAR-T耗竭减缓。

1.4 EGCG 对Raji 细胞活力、增殖能力的影响观察 ①PrestoBlue 法：取对数生长期的Raji 细胞，按4×104个/200 μL 接种于96 孔板，共4 组，每组6 个复孔，将EGCG 溶液稀释至不同浓度，按分组加入各组细胞中，每孔20 μL，使其终浓度分别为0 μmol/L（对照组）、10 μmol/L（低剂量组）、50 μmol/L（中剂量组）、100 μmol/L（高剂量组）。将细胞放入37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h，后取出96 孔板，每孔加入10 μL 的PrestoBlue 试剂，再将细胞放入细胞培养箱中。30 min后，将96孔板取出，使用多功能酶标仪检测，设置激发波长560 nm，发射波长为590 nm，读取各孔的荧光强度（FI 值）。按照以下公式计算细胞活力：细胞相对活力（%）=FI 样品/FI 对照×100%。②实时荧光定量PCR：用羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记Raji 细胞，然后用100 μmol/mL 的EGCG 处理标记的Raji 细胞24 h（EGCG 组），对照组为未经EGCG 处理的Raji 细胞，通过流式细胞仪监测，以FITC 信号强度来反应Raji细胞增殖能力，平均信号越强，则细胞增殖越弱。③AKT、ERK、PI3K、STAT3 mRNA：将100 μmol/mL 的EGCG 处理CAR-T 24 h（EGCG 组），对照组为未处理的CAR-T，分别提取两组细胞的总RNA，并通过反转录收获cDNA，使用实时荧光定量PCR 仪进行定量PCR 反应，用2-ΔΔCT方法计算AKT、ERK、PI3K、STAT3 mRNA 的相对表达量，以评价Raji细胞增殖，下调标志Raji细胞增殖受抑制。

1.5 EGCG 对CAR-T 杀伤Raji 细胞能力、效率的影响观察 ①杀伤Raji 细胞能力：采用荧光素酶化学发光法。取对数生长期的Raji细胞，按4×104/100 μL接种于96 孔板中，并分为4 组。对照组加入AIMV培养基和PBS，Raji + CAR-T 组加入CAR-T 和PBS，Raji + EGCG 组加入AIMV 培养基和EGCG 溶液，Ra‑ji + CAR-T + EGCG 组加入CAR-T 和EGCG 溶液，使各孔总体积为200 μL，其中CAR-T + Raji 组和CART + EGCG + Raji 组中效靶比为1︰1，EGCG + Raji 组和CAR-T + EGCG + Raji 组中EGCG 的终浓度为100 μmol/mL。放入细胞培养箱中，37 ℃、5%CO2条件下培养24 h。向各分组的每孔加入20 μL 的Bright-Lumi™萤火虫萤光素酶检测试剂，反应5 min后，选择化学发光检测模块，检测各分组孔中的光度值（RLU）。按照以下公式计算Raji 细胞活力，细胞相对活力（%）=（RLU样品/RLU对照）×100%，用于反应CAR-T 杀伤Raji 细胞的能力。②杀伤Raji 细胞效率：采用Annexin V-FITC 染色法。取对数生长期的Raji 细胞作为靶细胞，以每孔8×104个/100 μL 细胞接种于96 孔板中，并分为Raji 组（对照组）、Raji +EGCG 组、Raji + CAR-T 组、Raji + CAR-T + EGCG组。向各组细胞中分别加入相应的CAR-T（8×104个/100 μL）和EGCG（100 μmol/mL），培养12 h 后，将孔板中的细胞取出后洗涤收集，每个样本中加入45 μL 结合缓冲液、2.5 μL 的Annexin V-FITC 染色试剂和2.5 μL 的Anti-Human CD3-APC 染色试剂，孵育30 min 后，终止染色并使用流式细胞仪检测FITC 信号的凋亡细胞，并按以下公式进行计算杀伤效率：S=（D/Z-ND/NZ）×100%，公式中S 为杀伤效率，D 为杀伤组凋亡靶细胞数，Z 为杀伤组靶细胞总数，ND 对照组凋亡靶细胞数，NZ 为对照组靶细胞总数。

1.6 EGCG 对THP-1 细胞炎症因子mRNA 表达的影响观察 取对数生长期的人单核细胞白血病细胞（THP-1细胞），以每孔5×105个/mL细胞接种于12孔板中，豆蔻酰佛波醇乙酯（PMA，终浓度100 ng/mL）诱导细胞贴壁，24 h 后，分为对照组、模型组和EGCG 组，其中模型组和EGCG 组加入LPS（终浓度1 μg/mL）诱导炎症模型，同时EGCG 组加入EGCG（浓度为100 μmol/mL）干预，对照组不予处理。放入细胞培养箱中，37 ℃、5%CO2条件下培养24 h，收集细胞用于qPCR 检测。以细胞内多种炎症因子如TNF-α、IL-6、IL-8 等显著升高（P<0.05）作为模型成功标准。收集对照组、模型组和EGCG 组的THP-1细胞，分别提取3组细胞的总RNA，并通过反转录收获cDNA，使用实时荧光定量PCR 仪进行定量PCR反应。 用2-ΔΔCT方法计算COX-2、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA 的相对表达量（设对照组数据为1，EGCG 组和模型组为两组除以对照组所得的相对数据）。

1.7 统计学方法 采用Prism Graph Pad 8 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组CAR-T 活力、耗竭情况比较 低剂量组、中剂量组、高剂量组、对照组CAR-T 活力分别为102.18 ± 3.18、103.68 ± 1.44、107.51 ± 2.29、100.00 ± 2.27，中剂量组、高剂量组分别与对照组比较，低剂量组、中剂量组分别与高剂量组比较，P均<0.05。EGCG 组、对照组ID-3 mRNA 相对表达量分别为0.030 ± 0.06、1，TOX mRNA 相对表达量分别为0.062 ± 0.21、1，两组比较，P均<0.05。

2.2 各组Raji 细胞活力、增殖能力比较 低剂量组、中剂量组、高剂量组、对照组Raji 细胞活力分别为95.01 ± 9.69、91.97 ± 8.68、54.48 ± 15.13、100.00 ± 6.91，高剂量组分别与对照组比较，低剂量组、中剂量组分别与高剂量组比较，P均<0.05。EGCG 组、对照组FITC 信号荧光强度分别为166 543、2 477，两组比较，P<0.05。EGCG 组Raji 细胞AKT、ERK、PI3K、STAT3 mRNA 相对表达量分别为0.24 ± 0.12、0.59 ± 0.18、0.26 ± 0.09、0.23 ± 0.09，对照组分别为1、1、1、1，两组比较，P均<0.05。

2.3 各组CAR-T 杀伤Raji 细胞能力、效率比较 Raji + CAR-T + EGCG 组、Raji + EGCG 组、Raji+ CAR-T 组、对照组细胞相对活力分别为52.93 ±4.61、91.67 ± 6.79、51.26 ± 2.61、100.00 ± 5.45，对照组与其余3 组比较，Raji + CAR-T + EGCG 组、Raji + EGCG 组比较，P均<0.05。Raji + CAR-T 组、Raji + EGCG 组、Raji + CAR-T + EGCG 组的杀伤效率分别为10.29%、16.21%、16.65%，对照组与其余3 组比较，Raji + CAR-T 组、Raji + CAR-T + EGCG 组比较，P均<0.05。

2.4 两组THP-1 细胞炎症因子mRNA 表达比较两组THP-1细胞COX-2、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA相对表达量比较见表1。

表1 两组THP-1细胞COX-2、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA相对表达量比较（± s）

表1 两组THP-1细胞COX-2、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA相对表达量比较（± s）

注：与对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

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3 讨论

Burkitt's 淋巴瘤是一种高侵袭性的B 细胞淋巴瘤，具有生发中心表型，几乎普遍存在myc癌基因易位到增强子，且增殖能力越强（增殖指数大于95%），临床进展迅速。在美国，Burkitt's 淋巴瘤约占儿童非霍奇金淋巴瘤病例的40%，其总发病率为每年2.5 例/100 万人，且男性高于女性［15-16］。Burkitt's 淋巴瘤最常见的原发性疾病部位是腹部和淋巴组织［17］，其治疗手段和弥漫性大B 细胞淋巴瘤的治疗方法基本相同，主要以化疗为主，如R-CHOP、高剂量甲氨蝶呤和阿糖胞苷等。虽然上述方案取得了较好的治疗效果，但临床上仍有10%～15%的难治性/复发性病例出现，目前暂无有效的治疗方案，亟需新的治疗手段［18］。随着CAR-T 疗法的技术逐渐成熟，探索其在治疗难治性/复发性Burkitt's 淋巴瘤方面的应用具有重要的意义［19］。Raji 细胞是由R. J. V.Pulvertaft 在1963 年从一位患有Burkitt's 淋巴瘤的11 岁黑人男孩左上颌骨中取样建系，本实验中通过研究Raji细胞来验证CAR-T 及EGCG 对淋巴瘤的治疗作用。

CAR-T 疗法是一种能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法，尤其是针对靶向CD19 的CAR-T，在治疗白血病、非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤中具有良好的效果［20］。然而CAR-T 疗法作为一项新兴的技术，目前尚存诸多问题亟待解决，主要包括治疗过程中出现的CRS 等毒副作用，其主要原因是CAR-T 回输后，与机体的其他免疫细胞一同释放IL-6、IL-8、IL-10、粒细胞巨噬细胞刺激因子等细胞炎症因子［21-22］。还包括CAR-T耗竭造成的肿瘤复发，也是临床治疗中面临的难题。相关研究［23］指出，T 细胞长期处于炎性环境，是导致其耗竭的主要原因。研究人员尝试通过其他途径实现CAR-T 治疗的可调控，已有相关团队报道以白藜芦醇［24］、synNotch 受体［25］等方法调控CAR-T 功能。EGCG 作为绿茶中最主要的儿茶素类成分，具有多种生物学活性和药理学特性。EGCG 不仅具有强大的抗氧化和抗炎作用，还能够抑制肿瘤生长、预防心血管疾病、保护神经系统健康等多种作用。因此，我们使用EGCG 辅助CAR-T治疗，以期提升其治疗效果以及安全性。

本实验结果表明，在EGCG 处理24 h 后，100 μmol/L 处理的CAR-T 相对活力高于其他分组，表明该浓度下EGCG 对CAR-T增殖有一定的促进作用，且高于低、中剂量。而相同剂量下，Raji 细胞的相对活力显著降低，表明高剂量EGCG 抑制Raji 细胞增殖，且抑制能力与EGCG 剂量相关。CFSE 检测结果中，EGCG 组信号峰相较于对照组明显右移，表明EGCG 处理24 h 后，Raji 细胞的增殖能力被抑制，低于未处理细胞。随后我们通过两种方法对CAR-T以及EGCG 杀伤靶细胞Raji 的能力进行评估，首先是荧光素酶化学发光法，结果以Raji 细胞的相对活力表现，相较于对照组，各组相对活力均有下降，且Raji + CAR-T 组和Raji + CAR-T + EGCG 组下降更为显著，但这两组之间并无显著性差异；其次是An‑nexin V-FITC 染色法，结果以Raji 细胞凋亡水平表明，其中Raji + CAR-T + EGCG 组凋亡比率高于其他组，表明CAR-T与EGCG 联合使用时杀伤效率更高。我们探究了EGCG 在mRNA 水平调控CAR-T 和Raji细胞的机制，以GAPDH 作为内参，结果表明在CART 中EGCG 可以下调ID-3 和TOX mRNA 表达水平。其中TOX 由T 细胞受体高抗原刺激诱导，是T 细胞功能障碍和慢性感染期间耗竭T细胞维持的关键因素［26］，T 细胞耗竭是由于长期暴露与同源抗原减弱了T 细胞的效应能力，限制其治疗潜力［27-28］。而ID3则被证实其下调可以预防或延迟CAR-T 功能障碍［29］，这提示我们EGCG 可能通过对ID3 和TOX 的调控作用延缓CAR-T 的耗竭。而在Raji 细胞中，EGCG 下调AKT、PI3K、ERK 和STAT3的表达，PI3K/AKT 信号通路在调控细胞生存、生长和增殖中发挥重要作用［30-31］，RAF-MEK-ERK 级联在细胞增殖和生存的调控中起核心作用［32-33］，而STAT3 在肿瘤生态系统的肿瘤细胞和非肿瘤细胞中均广泛高度激活［34-36］。结果提示，EGCG 可能通过调控以上基因，抑制肿瘤细胞的增殖。最后，针对CAR-T 疗法过程中出现的不良反应，如CRS和神经毒性与接受CART 治疗患者血清中高水平的炎症蛋白和细胞因子有关［37-38］，而目前的治疗策略也侧重于抑制炎症相关因子来减少整体炎症反应［39］。我们通过THP-1细胞构建了炎症模型，使模型组中多种炎症因子表达水平相较对照组显著提高，而EGCG组中COX-2、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA 表达较模型组显著下调，表明EGCG 可能通过下调COX-2、IL-6、IL-8 和TNF-α，以缓解CAR-T治疗过程中产生的CRS等不良反应。

总之，EGCG 不仅可以提升CAR-T 活力，并减缓其耗竭，同时在不影响CAR-T 杀伤能力和效率的前提下，抑制Raji 细胞增殖及多种炎症因子表达。EGCG 提升了CAR-T 疗法的治疗效果以及安全性，二者联合使用具有较高的应用前景。