2种缓冲液对血清蛋白醋酸纤维膜电泳效果对比研究

于婧文，霍明章，2，李艳花，赵立峰，刘 宏，2*

（1.山西大同大学医学院，山西 大同 037009；2.山西大同大学呼吸病与职业病研究所，山西 大同 037009）

2种缓冲液对血清蛋白醋酸纤维膜电泳效果对比研究

于婧文1，霍明章1，2，李艳花1，赵立峰1，刘 宏1，2*

（1.山西大同大学医学院，山西 大同 037009；2.山西大同大学呼吸病与职业病研究所，山西 大同 037009）

目的在血清蛋白醋酸纤维膜电泳巴比妥缓冲液可以分离出5条区带的实验条件下，研究硼酸－硼酸盐缓冲液是否能够达到相同甚至更好的实验效果，是否可替代巴比妥缓冲液。方法采用DYY－8C型电泳仪进行醋酸纤维膜电泳，选择不同电压和电泳时间，观察巴比妥缓冲液与硼酸－硼酸盐缓冲液分离兔血清蛋白的效果，并分析2组蛋白质相对含量测定值有无差异。结果在相同的实验条件下，硼酸盐缓冲液的分离效果好于巴比妥缓冲液，2组蛋白质相对含量无明显差异。结论在血清蛋白醋酸纤维膜电泳实验中，与巴比妥缓冲液相比，硼酸缓冲液的实验结果更稳定且重复性更好，可以替代巴比妥缓冲液。

巴比妥缓冲液；硼酸盐缓冲液；醋酸纤维膜电泳

血清蛋白醋酸纤维膜电泳是生物化学与分子生物学的常用实验技术之一。巴比妥缓冲液是血清蛋白醋酸纤维膜电泳实验中最常用的缓冲液，但作为镇静类药物其可得性受到限制，安全性存在隐患。本研究在巴比妥缓冲液能够清晰分离出5条区带的4组实验条件下，观察硼酸盐缓冲液是否也能够分离出理想的图谱，并测定这2种缓冲液在不同实验条件下分离出的蛋白相对含量，判断其实验结果的差异，从而探讨在血清蛋白醋酸纤维膜电泳实验中，硼酸缓冲液是否可以替代巴比妥缓冲液。

1 实验材料

1.1 标本

新鲜兔血清，取自1只健康家兔，体质量2.8 kg，采其动脉血离心得血清。

1.2 仪器

DYY－8C型电泳仪4台、DYCP－38B型电泳槽8个（北京六一仪器厂），722型分光光度计。

1.3 试剂

醋酸纤维薄膜（台州市路桥四生化塑料厂）；巴比妥缓冲液（pH 8.6，离子强度0.06）：巴比妥1.66 g，巴比妥钠12.76 g，加热溶解，冷却至室温后，定容到1 L；硼酸盐缓冲液（pH 8.6，离子强度0.08）：硼酸5.60 g，硼酸钠5.610 g，氯化钠1.316 g，蒸馏水溶解并定容至1 L；丽春红染液，丽春红0.5 g，三氯醋酸6 g，蒸馏水溶解并定容至100 mL；漂洗液，V无水乙醇∶V冰醋酸∶V蒸馏水＝45∶5∶50；洗脱液，0.4mol／LNaOH。

2 方法

参照生物化学与分子生物学实验指导方法[1]进行。将醋酸纤维膜剪成2.5 cm×8 cm的长方形小片，浸泡到上述2种缓冲液中过夜待用。

2.1 点样

取浸泡好的醋酸纤维膜，夹于滤纸中吸去多余缓冲液，在无光泽面一端1.3 cm处画点样线，用载玻片一端均匀蘸取少量血清垂直点样，使血清均匀渗入薄膜中同时保持醋酸纤维膜的润湿。

2.2 电泳

每台电泳仪连接分别装巴比妥缓冲液和硼酸盐缓冲液的2个电泳槽，4台电泳仪共连接8个电泳槽。将点样后的醋酸纤维膜无光泽面向下，点样端靠近阴极，两端紧贴电泳槽上的纱布桥，拉直放好，每个电泳槽放置12条点样后的醋酸纤维膜，盖好电泳槽，平衡10 min后分别选择电压和电泳时间，打开开关，通电电泳。

2.3 染色及漂洗

丽春红染液染色5 min后取出用漂洗液漂洗数次，直至背景漂净为止。

2.4 定量

分别取各实验条件下的电泳效果较好的醋酸纤维薄膜各6条，将蛋白质各条色带和一空白色带剪下，分别装入6个试管，用0.4 mol／L NaOH溶液分别洗脱，30min后用722型分光光度计在波长620 nm进行比色，测各组分蛋白的百分含量。

2.5 实验条件

设定4种实验模式观察硼酸盐缓冲液与巴比妥缓冲液分离血清蛋白效果：①调节电压在110 V（10 V/cm桥长）,电泳时间60 min[1]；②先将电压调至60 V,电泳5 min后,再调到95 V,电泳55 min[2]；③电压130 V,电泳时间45min[3]；④电压160 V,电泳时间45min[4]。

2.6 统计学处理

用SPSS13.0对实验数据进行统计学处理。2种缓冲液分离出的血清蛋白含量比较采用配对样本t检验。

3 结果与分析

3.1 不同电压和时间对电泳结果的影响

在4组实验模式下巴比妥缓冲液都可得到清晰的图谱，硼酸盐缓冲液同样能分离出5条蛋白区带。蛋白电泳结果图如图1～8。2种缓冲液电泳情况比较见表1。比色测定2种缓冲液下分离出的各蛋白区带的相对含量取其平均值，测定结果见表2。统计学结果显示2组数据的相关系数r＝1，P＝0.88，2组数据无明显差异。

4种实验模式下观察硼酸盐缓冲液与巴比妥缓冲液分离血清蛋白效果，见图1～8。2种缓冲液电泳情况比较见表1。

图1 110V-60min巴比妥缓冲液

图2 110V-60min硼酸盐缓冲液

图3 60V-5m in,95V-55m in巴比妥缓冲液

图4 60V-5m in,95V-55m in硼酸盐缓冲液

图5 130V-45m in巴比妥缓冲液

图6 130V-45m in硼酸盐缓冲液

图7 160V-45m in巴比妥缓冲液

图8 160V-45m in硼酸盐缓冲液

3.2 2 种缓冲液洗脱各组分蛋白的结果

比色测定两种缓冲液下分离出的各蛋白区带的相对含量取其平均值,见表2。

4 结论

电压与电泳时间是影响电泳结果的重要因素之一。在4组实验模式下，硼酸盐缓冲液同巴比妥缓冲液一样都能分离出5条蛋白区带。在160 V－45 min条件下，两组图谱展开距离短，除清蛋白外，其它蛋白条带挤压，区带变细不利于区分。

表1 两种缓冲液电泳情况的比较

表2 不同实验条件下各组分蛋白质的相对含量

2种缓冲液的离子强度不同，蛋白迁移速度也不同。硼酸盐缓冲液的离子强度高，可能降低了蛋白质的带电量，使电泳的速度变慢，故4组实验模式下硼酸盐缓冲液的区带较集中，最远区带与点样点的距离较短。实验表明在不同的实验条件下硼酸盐缓冲液能够得到清晰的图谱甚至分离效果好于巴比妥缓冲液，而且实验的重复性和稳定性更好。

实验结果与靳彩虹测定兔血清蛋白含量结果[5]基本一致：清蛋白含量＞γ－球蛋白＞α1－球蛋白＞β－球蛋白＞α2－球蛋白。统计学结果说明，硼酸盐缓冲液与巴比妥缓冲液在分离各组分蛋白的含量方面差异没有显著性。

综上所述，在相同实验条件下，硼酸盐缓冲液同巴比妥缓冲液一样能够分离出清晰的图谱，甚至效果要好于巴比妥缓冲液。统计分析测定各组分蛋白质的相对含量，2种缓冲液差异没有显著性。多次重复实验证明，与巴比妥缓冲液相比，硼酸盐缓冲液中电泳出的图谱结果更稳定，重复性更好，而且成本较低，能够替代巴比妥缓冲液，更适合在生物化学与分子生物学实验中使用。

[1]李林,张月红,张宇辉,等.生物化学与分子生物学实验指导[M].北京：人民卫生出版社,2008.

[2]孙莉丽,李荣华.醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白实验的改进[J].实验室科学,2010,13（2）：58-59.

[3]陈书明,曹新鹏,胡军,等.6种血清的醋酸纤维薄膜电泳分析[J].山西农业科学,2010,38（6）：18-20.

[4]尹丽,陈秀敏,王永和,等.血清蛋白醋酸纤维膜电泳几种缓冲液的效果分析[J].中国医学创新,2010,7（11）：145-146.

[5]靳彩虹,柴连明,武洋.醋酸纤维素薄膜电泳法分离兔血清蛋白质[J].中国卫生检验杂志,2012,22（11）：2649-2650.

〔责任编辑 杨德兵〕

The Effect Separating Serum Protein w ith Cellulose Acetate Membrane Electrophoresis in Two Buffer Solution

YU Jing－wen1，HUOMing－zhang1，2，LIYan－hua1，ZHAO Li－feng1，LIU Hong1，2＊
（1.Medical School，ShanxiDatong University，Datong Shanxi，037009；
2.Research Institute of Respiratory and Occupational Disease，Shanxi Datong University，Datong Shanxi，037009）

Objective Boric acid－borate buffer can achieve the same or even better experimental effect in the experimental conditions that barbiturate buffer can separate out five ribbons in serum protein cellulose acetatemembrane electrophoresis.Methods Using DYY－8C electrophoresis apparatus for cellulose acetate membrane electrophoresis，choosing different voltage and time，the effect separating rabbit serum protein is observed in barbiturate buffer and boric acid－borate buffer.And the relative content of protein components ismeasured.Results Under the same experimental conditions，the effect separating serum protein in borate saline buffer is better than in barbiturate buffer.There is no difference between the two kinds of buffer.Conclusions In serum protein cellulose acetate membrane electrophoresis，the boric acid－borate buffer can replace barbiturate buffer，and many experiments prove that：the experimental results of boric acid－borate buffer ismore stable and repeatability is better than barbiturate buffer.

Boric acid－borate buffer；Barbiturate buffer；Cellulose acetatemembrane electrophoresis

O657.1

A

2012－08－08

于婧文（1984－），女，山西左云人，硕士，助理实验师，研究方向：生物化学教学与实验。*刘宏，男，博士；教授，通信作者。

1674－0874（2013）05－0058－03