姜黄素通过调节HMGB1/NF-κB通路对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用研究

王 琛,赵小建,孟 哲,李海禹,桑海强

心血管疾病中的急性心肌梗死是全球死亡的首要原因,目前的主要治疗策略为保证罪犯动脉血运的及时重建以保护冠状动脉血流[1]。然而,除了直接的缺血性损伤,血流的复灌也会对心肌组织造成损伤,称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury,MI/RI)[2]。MI/RI是急性心肌梗死病人预后的关键影响因素,并与心力衰竭的发生及12个月内的全因死亡率密切相关[3]。因此,预防及干预MI/RI期间的心肌细胞死亡至关重要。MI/RI期间心肌细胞稳态受损的确切机制尚未明确,涉及钙超载、炎症、细胞凋亡、自噬和氧化应激等多种机制的相互作用[4]。氧化/还原失衡介导的相关信号通路激活引起的氧化应激是早期MI/RI的重要病理过程[5]。此外,当梗死区域获得血运重建后,免疫细胞会识别梗死区域的坏死组织,进而激活免疫细胞内的炎症信号通路,引发炎症、氧化应激和细胞外基质成分沉积[6]。研究表明,在MI/RI期间,核因子-κB(NF-κB)信号通路被激活,启动心肌损伤相关基因的转录,尤其是炎症和凋亡蛋白,引发炎症级联反应从而加重MI/RI[7]。小檗碱可通过抑制高迁移率族蛋白B1(HMGB1)/Toll样受体4(TLR4)/NF-κB通路的激活从而减轻MI/RI[8]。中药在心血管疾病的临床应用中具有很大优势[9-11]。姜黄素(curcumin,Cu)是一种从植物中提取出的酚类化合物,为姜黄等的根茎,属于姜科,具有抗炎、抗氧化、防治糖尿病等功效[12-14]。本研究通过建立大鼠MI/RI模型,探讨姜黄素在MI/RI中的调节功能及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 姜黄素(货号:HY-N0005)购自美国MCE生物科技公司。苏木精-伊红(HE)染色试剂盒购自北京索来宝科技有限公司。H9c2细胞系购自中国科学院细胞库。白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6,货号:ERC003)、白细胞介素-1β(IL-1β,货号:900-K91)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α,货号:ERC102a)试剂盒均购自欣博盛生物科技有限公司。肌酸激酶(creatine kinase,CK,货号:BC1145)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH,货号:BC0685)活性检测试剂盒均购自北京索莱宝生物公司。四唑盐(MTT)细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自碧云天生物公司。HMGB1抗体(货号:6893)、核因子抑制蛋白(inhibitor kappa B alphaI,IκBα)抗体(货号:4814)、p-IκBα抗体(货号:2859)、NF-κB p65抗体(货号:8242)、p-NF-κB p65抗体(货号:3033)试剂盒均购自Cell Signaling Technology公司。多功能酶标仪(Thermo Fisher Scientific公司,1410101),化学发光呈像仪(上海天能公司,Tanon 5200),蛋白电泳转膜仪(上海天能公司, Tanon EPS600),全自动快速研磨仪(上海净信科技,Tissuelyser-96)。

1.2 实验动物 健康8周龄Sprague-Dawley大鼠100只,体质量250～300 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司上海分公司,动物许可证号:SCXK(沪)2022-0007,饲养于(23±2)℃的空调房中,12 h光照/黑暗循环。所有大鼠自由饮水饮食。

1.3 实验方法

1.3.2 心电图检测 采用BL-420S生物功能实验系统,在标准导联上获得造模7 d后大鼠MI/RI心电图,计算各组大鼠ST段电压。

1.3.3 心肌梗死面积的测定 处死大鼠并取出心脏,37 ℃下用1%的2,3,5-三苯基氯化四唑(TTC)溶液在黑暗中染色10～15 min,翻面后继续染色10～15 min。TTC与正常组织中的脱氢酶反应变红,而缺血组织中的脱氢酶活性降低而不能反应呈苍白色。拍照后利用Image Pro Plus软件计算梗死面积。

1.3.4 心脏病理变化的观察 用生理盐水清洗心脏组织,用4%的多聚甲醛固定24h后常规脱水包埋,按4 μm进行连续切片,固定于载玻片上,HE染色后光镜下观察。

1.3.5 细胞模型的构建 取对数生长期生长的H9c2细胞,分为对照组、缺氧/复氧组、姜黄素组,每组至少3个复孔。其中,对照组细胞正常培养于37 ℃,饱和有5%CO2、95%O2的培养箱中;缺氧/复氧组、姜黄素组细胞弃原培养液,用饱和有95%N2和5%CO2的缺氧液代替,于三相培养箱中连续曝气6 h模拟缺氧,用饱和有95%N2和5%CO2的混合气体复氧。其中,姜黄素组于缺氧模型构建前30 min于无血清培养基中加入浓度为20 μmol/L的姜黄素构建模型。

1.3.6 MTT法测定细胞活力 将H9c2细胞接种于96孔培养板中,待细胞生长良好并融合至80%左右时,每孔加入20 μL的MTT(5 mg/mL),连续培养4 h后,轻轻弃去上层液体,每孔加入100 μL二甲基亚砜(DMSO),振荡10 min后,采用多功能酶标仪检测各孔的吸光度A值(检测波长570 nm)。

1.3.7 CK、LDH、IL-6、IL-1β和TNF-α的测定 根据酶联免疫吸附测定法(ELISA)试剂盒说明书检测各组小鼠血清和细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平;采用酶活性检测试剂盒检测各组小鼠血清CK和LDH水平。

1.3.8 HMGB1、p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白检测 采用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)从裂解的心脏组织液和H9c2细胞中提取总蛋白进行HMGB1、p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白定量检测。将蛋白样品置于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中,将样品转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。转膜后,将含有蛋白样品的试纸条置于5%的脱脂牛奶中,室温下封闭2 h后,一抗中4 ℃孵育过夜。第2天,Tris-HCl缓冲盐溶液(TBST液)洗涤4次,每次10 min。将PVDF膜置于二抗溶液中,在摇床上室温孵育2 h后,用TBST洗涤4次,每次10 min。采用凝胶成像系统对蛋白条带进行均匀曝光和扫描并分析灰度值。

2 结 果

图1 各组大鼠心肌梗死面积比较(比例尺1∶50)

图2 各组大鼠心肌组织病理变化比较(×100)

表1 各组大鼠MI/RI引起的ST段变化水平比较(±s) 单位:mV

2.3 姜黄素对H9c2细胞活力的影响 与对照组比较,模型组、姜黄素组H9c2细胞活力降低,差异有统计学意义(P<0.05);与缺氧/复氧组比较,姜黄素组H9c2细胞活力明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。详见图3。

与对照组比较, ＊ P<0.01;与缺氧/复氧组比较,# P<0.01。图3 各组H9c2细胞活力比较

与对照组比较,＊ P<0.01,与模型组比较,# P<0.01。图4 各组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平比较(A为各组IL-1β比较;B为各组IL-6比较;C为各组TNF-α比较)

与对照组比较,＊ P<0.01;与缺氧/复氧组比较,# P<0.01。图5 各组H9c2细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平比较(A为各组IL-1β比较;B为各组IL-6比较;C为各组TNF-α比较)

与假手术组比较,＊ P<0.01;与模型组比较,# P<0.01。图6 各组大鼠血清CK、LDH水平比较(A为各组LDH比较;B为各组CK比较)

与对照组比较,＊ P<0.01;与缺氧/复氧组比较,# P<0.01。图7 各组H9C2细胞上清液中CK、LDH水平比较(A为各组LDH比较;B为各组CK比较)

图8 各组大鼠心肌组织中HMGB1/NF-κB通路相关蛋白表达条带图

与假手术组比较,＊ P<0.01;与模型组比较,# P<0.01。图9 各组大鼠心肌组织中HMGB1、p-IκBα、p-NF-κB p65水平比较(A为各组HMGB1比较;B为各组p-NF-κB p65比较;C为各组p-IκBα比较)

图10 各组H9c2细胞中HMGB1/NF-κB通路相关蛋白表达条带图

与对照组比较,＊ P<0.01;与缺氧/复氧组比较,# P<0.01。图11 各组大鼠H9C2细胞中HMGB1、p-IκBα、p-NF-κB水平比较(A为各组HMGB1比较;B为p-NF-κB p65比较;C为p-IκBα比较)

3 讨 论

缺血性心脏病,尤其是急性心肌梗死,是全球死亡的主要原因[15]。因此,针对缺血性心脏病及相关并发症的预防和治疗具有重要的临床意义。本研究结果显示,姜黄素干预可降低MI/RI大鼠的心肌酶和炎性因子水平,恢复MI/RI大鼠的ST段改变,并减轻心肌组织损伤,姜黄素对MI/RI的保护作用与抑制HMGB1/NF-κB信号通路的激活相关,提示姜黄素具有抗大鼠MI/RI作用。

早期MI/RI发生的病理过程主要是由氧化/还原失衡导致相关信号通路的激活,而引发的氧化应激所介导的[16]。研究表明,姜黄素可通过调节线粒体自噬来减轻大鼠的脑缺血再灌注损伤[17];也可通过上调核因子E2相关因子(Nrf2)的RNA水平从而上调超氧化物歧化酶的表达来减轻氧化应激损伤[18]。也有研究表明,姜黄素可抑制内质网应激,减少细胞内活性氧的产生,减轻细胞凋亡从而改善MI/RI[19]。此外,姜黄素可通过抑制炎症反应、减少凋亡、改善氧化应激损伤来发挥抗MI/RI作用[20]。本研究结果显示,姜黄素可改善MI/RI模型大鼠心电图ST段改变,减少心肌梗死面积,降低心肌酶水平,缓解心肌组织病理损伤,并抑制MI/RI中相关炎症通路的激活。

NF-κB信号通路作为最经典的炎症信号通路参与调控机体的免疫炎症反应。在缺氧/复氧诱导的H9c2细胞凋亡过程中,卡维地洛可通过抑制NF-κB通路来降低Bcl-2相关的凋亡蛋白的表达,从而抑制心肌细胞凋亡[6]。研究显示,在离体内皮细胞中,姜黄素可降低促炎转录因子NF-κB的DNA结合和转录活性从而抑制炎症信号通路的激活[21]。与上述研究类似,本研究结果发现,姜黄素可抑制NF-κB信号通路的激活,并下调其下游炎性因子的表达从而减轻MI/RI。HMGB1为存在于细胞核中的高度保守的转录因子,用于维持核小体结构和调节基因转录,后经证实其也是一种细胞因子,于细胞损伤时释放[22]。已研究表明,小檗碱可通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路的激活从而减轻MI/RI,提示HMGB1在MI/RI中的重要作用[8]。本研究结果也发现,姜黄素可阻断HMGB1/NF-κB通路的激活,并可下调TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎性细胞因子水平。

在动脉粥样硬化的载脂蛋白E敲除小鼠模型中,姜黄素可通过下调内皮细胞上的黏附分子来减少巨噬细胞浸润从而减轻血管炎症最终改善动脉粥样硬化[23]。姜黄素还通过降低全身炎性细胞因子(如IL-6、TNF-α和C-反应蛋白等)的水平减轻动脉粥样硬化[24]。此外,姜黄素还可降低人血管平滑肌细胞中单核细胞趋化蛋白1的表达减轻动脉粥样硬化[25]。在本研究中,MI/RI大鼠血清和缺氧/复氧的H9c2细胞上清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高,姜黄素干预可显著降低上述炎性细胞因子的水平。

本研究证实了姜黄素在MI/RI中的保护作用,也初步探索了姜黄素发挥抗MI/RI作用的可能机制。但本研究只进行了初步的探索,姜黄素发挥抗MI/RI作用是否还通过其他作用机制,如抑制线粒体应激或抑制其他信号通路激活来抑制炎症反应仍需要进一步深入研究。此外,本研究未检测丙二醛、超氧化物歧化酶等的水平,未能证实姜黄素是否也可抑制氧化应激反应发挥抗MI/RI作用。

综上所述,本研究结果表明,姜黄素可通过降低ST段抬高幅度,减少心肌缺血面积,降低心肌酶和炎性因子水平来减轻MI/RI,这种心肌保护作用可能是通过HMGB1/NF-κB通路介导的。