迷迭香酸对急性心肌梗死大鼠Treg/Th17平衡及NLRP3、IL-1β和IL-10水平的影响

魏 文,王 勇

《中国心血管健康与疾病报告2019概要》[1]显示,随着我国居民生活方式的改变,心血管疾病的发生率和病死率处于不断上升的阶段,已成为我国病死率最高的疾病。急性心肌梗死(AMI)等缺血性心肌病作为心血管疾病中最为常见且严重的一种,给个人和国家都带来了严峻的挑战。因此,探究和寻找对缺血性心肌病安全有效的防治策略具有重要的临床意义[2]。缺血等外界刺激可促进炎性小体NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)的转录翻译,升高的NLRP3通过激活下游信号通路直接诱导合成分泌白细胞介素-1β(IL-1β)等炎性因子,介导参与免疫反应[3]。调节性T细胞(Treg细胞)和辅助性T细胞17(Th17细胞)属于CD4+T细胞亚群,分别具有免疫抑制和促进炎症反应的功能,相关研究已证实,Treg细胞和Th17细胞在炎性环境中可以相互转化,导致Treg/Th17比例发生改变,二者的动态平衡参与了多种慢性炎性疾病的发生发展[4]。AMI等缺血性心肌病同样涉及多种白细胞亚群和炎性细胞因子的相互作用,冯金花等[5]研究证实,Treg/Th17失衡与AMI致心肌损伤密切相关。

中医药在AMI的治疗与预防中的使用较广泛,有助于改善AMI预后[6]。迷迭香酸(rosmarinic acid,RA)是1958年由Elis首次从唇形科植物迷迭香中分离获得,主要存在于唇形科、紫草科、葫芦科、椴树科、伞形科的多种植物中[7]。研究表明,迷迭香酸是一种具有多功能的天然活性物质,具有抗氧化、抗炎、抗菌、免疫调节等广泛的药理学作用[7]。因此,本研究拟探究迷迭香酸对AMI大鼠Treg/Th17平衡及对NLRP3、IL-1β和IL-10水平的影响,并分析其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠50只,体质量(230±30)g,购买于北京维通利华实验动物技术有限公司提供,实验动物合格证号:11400700058280,实验动物许可证号:SCXK(京)2016-0011。大鼠饲养期间自由进食水,光线各12 h明暗交替,饲养湿度(40±10)%,温度(25±2)℃。实验方案获实验动物伦理委员会批准。

1.2 实验仪器、药物和试剂 流式细胞仪(美国贝克曼库尔特科技有限公司);石蜡包埋机(德国Leica公司);石蜡切片机(德国Leica公司);光学显微镜(日本Olympus公司);电子天平(上海良品仪器厂);低温高速离心机(日本Hitachi公司);多功能图像分析系统(德国Leica公司)。迷迭香酸(Sigma公司,货号:R4033)。IL-1β酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(Sigma公司,货号:AB1832P);IL-10 ELISA试剂盒(Sigma公司,货号:RAB0246);NLRP3 ELISA试剂盒(Sigma公司,货号:SAB5700723);2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)试剂(Sigma公司,货号:17779);CD4-FITC抗体(Ebioscience,货号:11-0041-82);CD25-PE抗体(Ebioscience,货号:25-0251-82);CD127-PE-CY7抗体(Ebioscience,货号:25-1271-82);CD3-FITC抗体(Ebioscience,货号:11-0039-45);IL-17-PE(Ebioscience,货号:25-7177-82)。

1.3 动物分组和给药 将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、迷迭香酸低剂量组、迷迭香酸中剂量组、迷迭香酸高剂量组,每组10只。假手术组和模型组按10 mg/kg给予0.9%NaCl灌胃,迷迭香酸低剂量组、迷迭香酸中剂量组、迷迭香酸高剂量组分别给予迷迭香酸50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg灌胃,连续灌胃5 d后建立大鼠AMI模型,收集大鼠外周血及心肌标本待检。

1.4 大鼠AMI模型的建立 3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉大鼠,固定并行气管插管,连接小动物心电图机检测大鼠心电情况。于大鼠胸骨左缘第3肋、第4肋开胸,完全暴露心脏后,在前室间沟处可见左冠状动脉前降支(LAD)走形,用4-0丝线穿过大鼠LAD起始部,拉紧丝线结扎,阻断LAD致心肌缺血,此时心电图机记录到心电图ST-T抬高,说明大鼠AMI模型建模成功。

1.5 检测方法

1.5.1 苏木精-伊红(HE)染色观察心肌组织病理改变 将获取的心脏组织置于4%多聚甲醛固定液中固定48 h后,通过脱水、透明、浸蜡、包埋等过程获得石蜡块。将石蜡切片脱蜡,同时先后行苏木精染液染色和伊红染液染色,经过二甲苯和无水乙醇透明后,将已透明的切片滴上中性树脂封片,于光学显微镜下观察。

1.5.2 TTC染色检测心肌梗死面积 AMI 2 h后,打开大鼠腹腔,充分暴露下腔静脉,现配现用TTC液,以肾脏水平为穿刺点,朝向头部穿刺下腔静脉并推注约1 mL TTC液。15 min后静脉注射氯化钾(75 mg/kg)处死大鼠并取出心脏,清洗心肌组织后置于-80 ℃冰箱内冰冻20 min后切片。心脏切片用0.9%NaCl清洗后放入多聚甲醛中固定显色,最终白色为梗死区域,根据白色区域面积占比大小评估梗死情况。

1.5.3 ELISA法测定NLRP3、IL-1β及IL-10水平 左室心肌组织匀浆后,4 ℃,3 000 r/min离心15 min后取上清液于-20 ℃进行检查。按照ELISA试剂盒操作说明书检测NLRP3、IL-1β及IL-10水平。

1.5.4 流式细胞仪检测外周血单个核细胞(PBMC)中Treg/Th17 缺血2 h后打开大鼠腹腔于下腔静脉处取血5 mL至抗凝管中,采用密度梯度离心法进行PBMC的分离。将下腔静脉血与等量磷酸盐缓冲液(PBS)及淋巴细胞分离液混合均匀,然后室温下1 500 r/min离心15 min将混合液分为4层,吸取第2层细胞至15 mL离心管中,加入3倍的PBS混匀,再次室温下1 000 r/min离心10 min后弃上清液并重悬细胞,将PBMC浓度调整至2×106/mL。

1.5.4.1 Treg细胞检测 将分离好的PBMC加入24孔板上,加入CD4-FITC抗体,4 ℃下避光孵育20 min后加入CD25-PE抗体进行透膜/固定30 min,然后加入CD127-PE-CY7抗体。最后加入预冷的PBS 2 mL离心并重悬细胞,上流式细胞仪检测。以CD4-FITC同型对照抗体作为对照,加入同型对照抗体。

1.5.4.2 Th17细胞检测 将分离好的PBMC加入24孔板上,加入25 ng/mL的丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)、1 μg/mL的离子霉素、1.4 μg/mL的莫能霉素和3 μg/mL的布雷菲德菌素A(BFA),混匀后在37 ℃、5%CO2培养箱中培养5 h。完成后1 300 r/min离心10 min,去上清,加入CD3-FITC抗体,4 ℃下避光孵育20 min;透膜/固定30 min后加入IL-17-PE抗体。最后加入预冷的PBS 2 mL离心并重悬细胞,上流式细胞仪检测。以CD3-FITC同型对照抗体作为对照。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌组织病理改变 假手术组大鼠心肌组织未见异常变化。模型组大鼠心肌组织紊乱,心肌变性、坏死明显,细胞间质水肿明显,还有大量炎性细胞浸润。不同浓度迷迭香酸预处理可使心肌细胞变性坏死得到改善,且这种改变呈剂量依赖性。详见图1。

图1 各组大鼠心肌组织病理改变(×200)(A为假手术组,B为模型组,C为迷迭香酸低剂量组,D为迷迭香酸中剂量组,E为迷迭香酸高剂量组)

2.2 各组大鼠心肌梗死面积比较 与模型组比较,迷迭香酸低剂量组、迷迭香酸中剂量组、迷迭香酸高剂量组大鼠心肌梗死面积均减小,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠心肌梗死面积比较(±s) 单位:%

2.3 各组大鼠NLRP3、IL-1β及IL-10蛋白表达比较 与假手术组比较,模型组NLRP3、IL-1β升高,IL-10下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,迷迭香酸低剂量组、迷迭香酸中剂量组、迷迭香酸高剂量组NLRP3、IL-1β表达减低,IL-10水平升高,且呈剂量依赖性,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠NLRP3、IL-1β、IL-10蛋白表达比较(±s)

2.4 各组大鼠外周血PBMC中Treg和Th17细胞比较 与假手术组比较,模型组中Treg细胞占比下降,Th17细胞占比升高,Treg/Th17值下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,迷迭香酸低剂量组、迷迭香酸中剂量组、迷迭香酸高剂量组Treg细胞占比增加,Th17细胞占比降低,Treg/Th17值升高,且呈剂量依赖性,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠外周血PBMC中Treg和Th17细胞比较(±s)

3 讨 论

本研究结果显示,AMI大鼠心肌NLRP3水平、外周血Th17细胞占比及Th17细胞相关细胞因子IL-1β水平显著增高,Treg细胞占比及Treg细胞相关细胞因子IL-10水平明显下降;而迷迭香酸低、中、高剂量组可减轻心肌梗死面积,改善心肌细胞变性坏死,降低NLRP3、IL-1β水平及Th17细胞占比,升高IL-10水平、Treg细胞占比及Treg/Th17值,且以上改变呈剂量依赖性,表明迷迭香酸对急性心肌梗死心肌具有有效的保护作用,其作用可能是通过升高Treg/Th17比值,调节炎症相关因子NLRP3、IL-1β及IL-10的表达实现的。

NLRP3是人体免疫的重要调控者,其可由各种激活剂触发[8]。NLRP3的特征为其N端热蛋白结构域可通过同型相互作用招募凋亡相关斑点样蛋白(ASC),进而通过Caspase募集域同型相互作用征集Caspase-1前体,完成NLRP3炎性小体的组装,促使Caspase-1的活化和IL-1β的生成,激活并放大炎症反应,从而导致细胞和组织损伤[3,8]。研究表明,NLRP3的表达水平与AMI病情严重程度密切相关[9]。吴蔚等[10]研究表明,NLRP3的高表达与冠心病的发生发展密切相关,与冠状动脉正常对照组比较,冠心病病人血清NLRP3表达水平显著增高。Jaén等[11]研究显示,AMI发生后,激活后的NLRP3还可活化核因子-κB(NF-κB),促使IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等促炎因子的释放,而释放的炎症介质又可进一步促进NLRP3合成分泌,形成炎症正反馈。Treg和Th17两种CD4+T细胞亚型在AMI的发生和进展过程中发挥重要作用,Treg细胞及IL-10可抑制AMI所致的心肌损伤,而Th17细胞及IL-1β却加速了AMI的进展,在AMI动物模型和冠心病病人中均发现存在Treg/Th17失衡[12-15]。本研究结果显示,与假手术组比较,AMI大鼠心肌组织中NLRP3的表达升高,外周血中Th17细胞占比及Th17细胞相关细胞因子IL-1β水平显著增高;而Treg细胞占比及Treg细胞相关细胞因子IL-10水平明显下降,与既往研究结果一致。

相关研究证实,中医药可能为有效防治AMI等缺血性心肌病带来新希望[16]。中医药理论认为,AMI等缺血性心肌病存在血瘀病症。药理研究表明,迷迭香酸可通瘀血,在改善缺血性损伤、抗炎及抗氧化方面有良好的药理活性及较高的开发潜质[17]。李丽等[18]研究发现,迷迭香酸可通过提高氧化酶活性、增强自由基清除能力而对大鼠冠状动脉结扎后引起的心肌缺血损伤发挥保护作用。张鑫等[19]研究显示,迷迭香酸可有效降低过氧化氢所致心肌细胞的凋亡和氧化应激损伤。

综上所述,迷迭香酸可以增加Treg/Th17值,降低AMI心肌中NLRP3、IL-1β蛋白的高表达,同时增加IL-10表达,从而减小心肌梗死面积,发挥心肌保护作用。