circRNA-6874/miR-30a/STIM2通路干预心肌细胞缺氧/复氧损伤的机制研究

别自东,郭 影

心肌缺血后在恢复血流灌注过程中出现的心肌损伤进一步加重为心肌缺血/再灌注损伤(MI/RI)[1]。MI/RI在心血管系统疾病的治疗过程中较常出现,给病人的手术治疗带来了极大的困扰[2]。因此,减轻MI/RI对预后具有重要的临床意义。研究表明,非编码RNA在MI/RI的发生过程中发挥重要作用[3-4]。缺氧/复氧(H/R)可导致miR-30a在心肌细胞中的表达明显减少,上调miR-30a的表达可明显减少H/R诱导的心肌细胞存活力下降和凋亡[5]。另一种非编码RNA——环状RNA(circRNA)同样在各种心肌疾病中发挥关键作用[6]。circRNA的功能与微小RNA(miRNA)密切相关[7]。在线工具分析显示,circRNA-6874含有miR-30a的结合位点,且基质相互作用分子2(STIM2)是miR-30a的一个重要下游靶基因[8]。STIM2参与了多种心血管疾病的发生发展[9]。本研究探讨circRNA-6874是否通过调控miR-30a/STIM2在H/R中发挥作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 人心肌细胞和专用心肌细胞培养基购自ScienCell研究实验室;胎牛血清、双抗、Lipofectamine 2000和SYBR Green PCR Master Mix购自美国赛默飞公司;Magna RIP试剂盒购自美国Merck公司;siRNAs和miRNAs购自广州锐博公司;荧光探针DCFH-DA、细胞计数试剂盒(CCK-8)、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)试剂和化学发光底物(ECL)购自上海碧云天公司;STIM2抗体和二抗购自美国Abcam公司;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂购自南京建成生物工程研究所;双荧光素酶报告载体和Dual Glo Luciferase Assay System购自美国Promega公司;细胞培养箱购自日本三洋公司;定量PCR仪购自美国ABI公司;荧光酶标仪购自美国赛默飞公司等。

1.2 心肌细胞H/R模型的构建 人心肌细胞用含5%胎牛血清、双抗和1%心肌细胞生长添加物的专用心肌细胞培养基进行培养。无糖培养基先用含95%N2和5%CO2的气体预处理30 min后加入心肌细胞中。将上述细胞置于37 ℃及含94%N2、1%O2、5%CO2的培养箱中缺氧培养8 h,然后更换正常培养基于37 ℃、含5%CO2的培养箱中复氧培养24 h。

1.3 RNA结合蛋白免疫沉淀 采用Magna RIP试剂盒进行RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验。离心收集1×107个心肌细胞,加入RIP Lysis Buffer裂解。先将磁珠与Argonaute 2(AGO2)抗体、阴性对照免疫球蛋白G(IgG)进行结合,然后加入到上述细胞裂解物中4 ℃孵育过夜。分离提取沉淀的RNA,逆转录后采用荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测circRNA-6874、miR-30a的表达水平。

1.4 双荧光素酶报告基因实验 将circRNA-6874的全序列或STIM2的3′-非编码区(3′-UTR)序列克隆到双荧光素酶报告载体中,所得质粒定义为野生型质粒。将上述野生型质粒中miR-30a的结合位点进行突变,获得突变型质粒。上述质粒分别与miR-30a模拟物(mimics)转染细胞,用Dual Glo Luciferase Assay System检测荧光素酶活性的变化。

1.5 细胞转染和RT-qPCR检测 胰酶消化和收集心肌细胞,调整细胞浓度后接种于6孔培养板中。第2天采用Lipofectamine 2000对circRNA-6874 siRNA、miR-30a mimics和STIM2 siRNA分别进行转染,同时circRNA-6874 siRNA和miR-30a抑制物(inhibitors)、miR-30a mimics和STIM2过表达载体(STIM2-O)、circRNA-6874 siRNA和STIM2-O分别进行共转染。转染4 h后再进行H/R处理,继续培养48 h后收集心肌细胞,提取RNA后进行逆转录。根据SYBRTMGreen PCR Master Mix说明书进行RT-qPCR检测circRNA-6874、miR-30a和STIM2表达,采用2-ΔΔCt法分析RNA的表达水平。

1.6 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测 收集心肌细胞,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤,加入含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液进行裂解。测定上述裂解物的蛋白含量,进行15%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳完毕后将蛋白条带转移到硝化纤维素膜中,加入STIM2抗体孵育2 h。再继续加入二抗孵育,用化学发光底物(ECL)显影蛋白条带,定量分析蛋白相对表达水平。

1.7 细胞存活力检测 胰酶消化和收集心肌细胞,调整细胞浓度后接种于96孔培养板中。分别转染后进行H/R处理,然后用CCK-8法检测细胞存活力。每孔加入10 μL CCK-8溶液,混匀后继续培养2 h,使用酶标仪测定光吸收值(450 nm),计算细胞存活力。

1.8 心肌细胞损伤检测 离心收集心肌细胞的培养上清液,按试剂盒说明书用全自动生化分析仪检测LDH的浓度,由此评估心肌细胞的损伤水平。

1.9 心肌细胞活性氧(ROS)检测 先用无血清培养基将荧光探针DCFH-DA稀释至10 μmol/L,往培养的细胞中加入适量DCFH-DA,放置于37 ℃培养箱中孵育20 min,期间间隔几分钟混匀一下,完成后用无血清培养基洗涤细胞,最后用荧光分光光度计检测ROS水平。

1.10 TUNEL检测细胞凋亡 用PBS洗涤培养的心肌细胞,然后在4 ℃下用4%甲醛固定25 min。加入0.2% tritonx-100继续孵育5 min后,加入100 μL平衡缓冲液于室温下放置10 min。细胞继续与50 μL含核苷酸混合物和TdT的TUNEL反应混合物于37 ℃下作用60 min,然后用柠檬酸钠盐缓冲液(SSC)洗涤细胞15 min。分别用0.3% H2O2和链霉亲和素工作液于室温下处理细胞10 min和30 min。最后加入0.5 μg/mL DAPI作用5 min,于荧光显微镜下进行观察拍照。

1.11 Caspase-3活性检测 将心肌细胞裂解物和特定底物置于96孔板中,37 ℃培养2 h。在激发波长为380 nm和发射波长为440 nm的荧光酶标仪中,通过测量荧光强度测定Caspase-3酶的活性。

2 结 果

2.1 H/R诱导circRNA-6874表达而抑制miR-30a的表达 用ENCORI(http://starbase.sysu.edu.cn/)在线工具分析具有潜在miR-30a结合位点的circRNAs发现,circRNA-6874(hsa_circ_0077722)具有多个miR-30a的结合位点(见图1)。进一步用RIP实验检测可见,AGO2抗体显著富集circRNA-6874和miR-30a(见图2)。另外,双荧光素酶报告基因实验表明,含野生型circRNA-6874序列的质粒与miR-30a共转染时,荧光素酶活性明显下降(P<0.05);当将circRNA-6874序列中miR-30a的结合位点进行突变(突变型)后,荧光素酶活性变化不明显(见图3,P>0.05)。上述实验表明,circRNA-6874能与miR-30a直接结合。将心肌细胞进行H/R处理时,circRNA-6874的表达明显上调,而miR-30a的表达明显下降(P<0.05);抑制circRNA-6874表达(H/R+circRNA-6874 siRNA)后,miR-30a的表达明显回升(见图4、图5,P>0.05)。因此,H/R会导致circRNA-6874在心肌细胞中的表达上调,进而抑制miR-30a的表达。

图1 circRNA-6874序列中miR-30a的结合位点

与IgG比较,＊ P<0.05。图2 RIP检测AGO2抗体富集circRNA-6874和miR-30a的量

与NC miRNA比较,＊ P<0.05图3 双荧光素酶报告基因实验检测circRNA-6874和miR-30a的结合能力

与空白对照比较,＊P<0.05。图4 RT-qPCR检测circRNA-6874表达水平

与空白对照比较,＊ P<0.05。图5 RT-qPCR检测miR-30a表达水平

2.2 H/R通过circRNA-6874/miR-30a促进STIM2的表达 同时用ENCORI分析miR-30a的下游靶基因发现,STIM2是其中一个重要的靶基因,其序列中含有多个miR-30a的结合位点(见图6)。将STIM2的3′非编码区克隆进双荧光素酶载体(野生型)后与miR-30a模拟物共转染进细胞,可见荧光素酶活性明显下降(P<0.05);将miR-30a的结合位点进行突变(突变型)后,荧光素酶活性明显回升(见图7,P>0.05),表明miR-30a能与STIM2结合。与空白对照组比较,H/R组、H/R+circRNA-6874 siRNA+miR-30a inhibitors组、H/R+miR-30a mimics+STIM2-O组和H/R+circRNA-6874 siRNA+STIM2-O组中STIM2的表达明显上调(P<0.05),而H/R+circRNA-6874 siRNA组和H/R+miR-30a mimics组中STIM2的表达明显回调(见图8～图10,P>0.05)。因此,H/R能通过circRNA-6874/miR-30a促进心肌细胞表达STIM2。

图6 STIM2序列中miR-30a的结合位点

与NC miRNA比较,＊ P<0.05。图7 双荧光素酶报告基因实验检测STIM2和miR-30a的结合能力

与空白对照比较,＊ P<0.05。图8 RT-qPCR检测STIM2的mRNA水平

图9 Western Blot检测STIM2的蛋白表达条带图

与空白对照比较,＊ P<0.05。图10 Western Blot检测STIM2的蛋白表达水平(NC为心肌细胞转染阴性siRNA、miRNA和空载体)

2.3 circRNA-6874/miR-30a/STIM2参与H/R诱导的心肌细胞损伤和氧化应激 进一步检测circRNA-6874/miR-30a/STIM2通路在心肌细胞中的功能发现,与空白对照组比较,H/R组、H/R+circRNA-6874 siRNA+miR-30a inhibitors组和H/R+miR-30a mimics+STIM2-O组的细胞存活力下降、心肌损伤主要标志物LDH的释放和ROS的产生增强(见图3,均P<0.05);H/R+circRNA-6874 siRNA组、H/R+miR-30a mimics组和H/R+STIM2 siRNA组的细胞存活力明显恢复、LDH释放量减少和ROS生成下降(见图11,P>0.05),表明H/R诱导的细胞损伤和氧化应激水平明显减弱。因此,H/R诱导心肌细胞损伤和氧化应激通过circRNA-6874/miR-30a/STIM2通路进行。

与空白对照比较,＊ P<0.05。图11 H/R通过circRNA-6874/miR-30a/STIM2诱导心肌细胞损伤和氧化应激[心肌细胞分别转染circRNA-6874 siRNA、miR-30a mimics、circRNA-6874 siRNA和miR-30a inhibitors、miR-30a mimics和STIM2过表达载体(STIM2-O)、STIM2 siRNA后再进行H/R处理。A为用CCK-8法检测心肌细胞存活力;B为生化分析仪检测LDH释放量;C为荧光探针DCFH-DA检测ROS生成量。NC:心肌细胞转染阴性siRNA、miRNA和空载体]

2.4 circRNA-6874/miR-30a/STIM2调控H/R条件下心肌细胞的凋亡进程 同时检测心肌细胞凋亡表明,与空白对照组比较,H/R组、H/R+circRNA-6874 siRNA+miR-30a inhibitors组和H/R+miR-30a mimics+STIM2-O组的细胞凋亡和Caspase-3活性明显增加(见图12～图14,P<0.05);H/R+circRNA-6874 siRNA组、H/R+miR-30a mimics组和H/R+STIM2 siRNA组的细胞凋亡水平和Caspase-3活性回落(P>0.05)。因此,H/R通过circRNA-6874/miR-30a/STIM2而激活凋亡通路,进而促进心肌细胞凋亡。

图12 TUNEL检测心肌细胞凋亡水平荧光图

与空白对照比较,＊ P<0.05。图13 TUNEL检测心肌细胞凋亡水平

与空白对照比较,＊ P<0.05。图14 荧光酶标仪检测Caspase-3活性

3 讨 论

多种非编码RNA的发现和作用机制的研究表明,其在多种疾病的进展过程中具有重要价值[10]。其中,miRNA是发现较早且研究较多的非编码RNA,其在多种心血管疾病的发生发展中发挥关键的调控作用,并有可能成为疾病的特异性标志物[11-12]。本研究表明,miR-30a在H/R心肌细胞中的表达明显下调,上调miR-30a的表达会明显逆转H/R诱导的心肌细胞损伤、氧化应激和凋亡增加,表明miR-30a是一种心肌保护性miRNA,在心肌损伤过程中具有重要意义。Li等[13]研究发现,miR-30a在MI/RI小鼠心肌细胞中的表达明显下调,而丹酚酸B可通过上调miR-30a表达增强细胞存活力、减少LDH释放和抑制自噬,用miR-30a抑制物下调miR-30a表达可逆转丹酚酸B抑制MI/RI损伤的作用。Guo等[14]研究发现,miR-30a在氧糖剥夺的大脑皮质神经元和大脑中动脉闭塞再灌注的小鼠大脑皮质中的表达明显下调,其表达增强会抑制自噬和缺血损伤,从而减轻缺血性脑卒中病人的神经细胞死亡。另外,miR-30a可靶向抑制结缔组织生长因子(CTGF)的表达而减少心肌梗死后心肌胶原的生成,进而抑制心肌纤维化,从而改善心功能[15]。

本研究结果显示,miR-30a可靶向抑制STIM2的表达。研究表明,STIM2和STIM1通过促进Ca2+内流而在多种心血管疾病中发挥重要作用[16-18]。Tu等[19]在H9c2和原代新生儿心肌细胞中的研究发现,STIM2在MI/RI损伤的细胞中表达上调,抑制STIM2表达会减少内质网钙释放和线粒体钙超载,从而减轻线粒体损伤并维持线粒体功能,最终减少MI/RI损伤诱导的细胞凋亡。同时,在神经系统中的研究也有类似的发现,研究表明,STIM2是缺血诱导神经元胞浆Ca2+积聚所必需的;与野生型对照组比较,STIM2-/-小鼠神经元在缺氧条件下的存活率明显提高;在体内局灶性脑缺血模型中,STIM2-/-小鼠对神经损伤有明显的保护作用[20]。上述结果均与本研究结果类似。

circRNA是具有多种调控功能的非编码RNA[21]。研究表明,circRNA通过多种作用机制在心血管等各种疾病中发挥重要作用[22]。本研究结果显示,circRNA-6874在H/R心肌细胞中表达上调,抑制其表达会导致miR-30a表达增强,而STIM2表达抑制,同时减少H/R诱导的心肌细胞损伤和凋亡,表明circRNA-6874/miR-30a/STIM2可能是H/R诱导损伤的一条关键通路。Ge等[23]分离检测MI/RI心脏所释放的胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)中circRNA的表达谱,共鉴定出185个明显差异表达的circRNAs,其中MI/RI组与假手术组比较下调119个、上调66个,揭示了circRNA在假手术和MI/RI心脏组织胞外囊泡中的特异表达模式,为circRNA和胞外囊泡参与MI/RI损伤提供了一些可能的靶点和途径,为circRNA和胞外囊泡在心脏MI/RI病理过程中的作用提供了重要依据。Hu等[24]研究表明,H/R诱导circSAMD4A水平上调,抑制circSAMD4A表达可减少H/R诱导的细胞凋亡和炎症反应;circSAMD4A在体内外抑制miR-138-5p的表达,从而促进H/R诱导的心肌细胞损伤。

综合上述,circRNA-6874/miR-30a/STIM2通路可能通过促进氧化应激和凋亡促进H/R诱导的心肌细胞损伤。