血清miR-29b、miR-371表达与中晚期肝细胞癌患者Th1/Th2平衡、临床病理特征及预后的关系*

张燕燕,江龙龙,赵春燕,尹伦财,卿 松

重庆市大足区人民医院:1.肿瘤科;2.普外科,重庆 402360

肝细胞癌(HCC)是全球第五大常见恶性肿瘤,是癌症相关死亡率的第三大原因[1]。HCC早期缺少特异性表现,确诊时多处于中晚期,丧失最佳根治手术治疗时机,5年生存率小于18%[2]。目前中晚期HCC患者的治疗以肝动脉化疗栓塞(TACE)为主,在阻断肿瘤肝动脉血供同时,配合局部化疗药物杀伤肿瘤,能延长患者生存时间[3]。但肿瘤组织缺氧状态仍会诱导缺氧诱导因子表达,促进肿瘤血管新生,导致肿瘤复发转移及患者不良预后[4]。因此,深入研究中晚期HCC疾病机制,寻找新的中晚期HCC预后相关标志物,具有重要意义。微小核糖核酸是长度20～25个核苷酸的非编码RNA分子,参与机体发育、分化及肿瘤等多种生理病理过程调节。近年来发现,miR-29b、miR-371是在HCC癌组织中差异性表达较为显著的miRNA[5-6],二者可影响HCC肿瘤微环境中免疫细胞的功能、辅助性T细胞1型(Th1)及2型(Th2)细胞因子平衡[7-8],促进HCC进展。本研究通过检测HCC血清miR-29b、miR-371表达水平,分析其与临床病理特征、Th1/Th2平衡及预后的关系,以期为中晚期肝癌患者临床治疗和预后改善提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年1月至2019年2月本院收治的98例HCC患者作为HCC组。纳入标准:(1)经病理穿刺活检组织学、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)等影像学检查明确诊断为HCC,诊断符合《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》[9],符合巴萨罗那分期(BCLC)[10]标准中的B、C期;(2)患者不适宜或不愿意接受手术治疗,同时接受TACE治疗;(3)初次诊治,既往无放化疗等治疗史;(4)临床资料完整。排除标准:(1)伴严重心、肺、肾等脏器功能不全;(2)肝功能Child-Pugh评分C级;(3)肝内病灶数目>3个,肿瘤广泛远处转移,卡氏体力状态(KPS)评分<70分,预计生存期<3个月;(4)合并血液系统疾病等。HCC组男63例,女35例;年龄33～78岁,平均(55.1±7.8)岁;Child-Pugh分级:A级58例,B级40例;KPS评分:>90分70例,70～90分 28例;术前甲胎蛋白(AFP):<400 μg/L 67例,≥400 μg/L 31例;CT或MRI检查测量肿瘤最大径(多病灶时选取最大者测量肿瘤最大径)≤5 cm 38例,>5 cm 60例;病灶个数:1个54例,≥2个44例。另选取同期在本院就诊或体检的52例肝脏良性疾病患者为疾病对照组,60例健康体检者为对照组。疾病对照组男32例,女20例;年龄33～78岁,平均(54.8±7.6)岁;慢性乙型肝炎25例,酒精性肝病13例,脂肪肝14例。对照组男39例,女21例;年龄32～77岁,平均(54.5±7.5)岁。3组年龄、性别等一般资料比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院医学伦理委员会批准通过。所有受试者及家属对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1血清miR-29b、miR-371检测 采集研究对象空腹静脉血约5 mL,3 000 r/min离心5 min分离上层血清,-80 ℃冰箱保存。用Trizol法提取血清总RNA,Narodrop1000(美国赛默飞世尔科技公司)检测RNA纯度,A260/A280在1.9～2.1为符合要求。采用RNA逆转录试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]将RNA逆转录为cDNA,反应条件为42 ℃ 30 min,然后进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)。miR-29b的正向引物序列为5′-GCGTAGCACCATTTGAAATC-3′,反向引物序列为5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′;miR-371正向引物序列为5′-GCAGTGGCTGAACCAAGGAGAC-3′,反向引物序列为 5′-GCCGTGAGCTGTGCAGGTG-3′;内参U6的正向引物序列为5′-AATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′,反向引物序列为5′-TCGCTCCTGGAAGATGGTGATGG-3′。PCR总反应体系为10 μL:cDNA 1 μL,正、反向引物各1 μL、SYBR Green Premix 5 μL,双蒸水2 μL。反应条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性15 s,60 ℃退火60 s,72 ℃延伸15 s,共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算miR-29b、miR-371的相对表达水平。根据miR-29b、miR-371相对表达水平的平均值,将HCC组分为miR-29b低表达组、高表达组,以及miR-371低表达组、高表达组。

1.2.2Th1/Th2型细胞因子检测 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-2、IL-4及IL-10水平。试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。实验步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.2.3随访 所有患者出院后开始进行随访,以电话、门诊复查方式进行随访,随访内容为患者生存情况,出院后第1年每3个月随访1次,第2～3年每半年随访1次。随访时间截至2022年3月1日或患者死亡。

2 结 果

2.13组血清miR-29b、miR-371水平与Th1/Th2型细胞因子比较 与疾病对照组及对照组相比,HCC组血清miR-29b、IFN-γ、IL-2水平明显较低,miR-371、IL-4、IL-10水平明显较高,差异均有统计学意义(P<0.05),而疾病对照组与对照组间血清miR-29b、miR-371、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组血清miR-29b、miR-371水平与Th1/Th2型细胞因子比较

2.2中晚期HCC患者血清miR-29b、miR-371与Th1/Th2型细胞因子的相关性 Pearson相关分析显示,中晚期HCC患者血清miR-29b与IFN-γ、IL-2表达呈正相关(P<0.001),与IL-4、IL-10呈负相关(P<0.001);血清miR-371与IFN-γ、IL-2表达呈负相关(P<0.001),与IL-4、IL-10呈正相关。见表2。

表2 中晚期HCC患者血清miR-29b、miR-371与Th1/Th2型细胞因子的相关性

2.3血清miR-29b、miR-371水平与中晚期HCC患者临床病理特征的关系 不同肝功能Child-Pugh分级、肿瘤最大径及病灶个数的HCC患者血清miR-29b、miR-371表达差异有统计学意义(P<0.05),不同性别、年龄、KPS评分、术前甲胎蛋白(AFP)的HCC患者血清miR-29b、miR-371表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 血清miR-29b、miR-371水平与临床病理特征的关系

2.4血清miR-29b、miR-371水平对中晚期HCC患者生存预后的影响 98例HCC组患者随访时间7～36个月,平均(23.2±3.7)个月,随访过程中失访2例,患者随访期内死亡44例。根据miR-29b、miR-371相对表达水平的平均值,最终miR-29b低表达组50例,高表达组48例,miR-371低表达组47例,高表达组51例。miR-29b低表达组、高表达组平均生存期分别为(18.1±3.2)、(28.2±3.7)个月,Log-rank检验结果显示,miR-29b低表达组患者的累积总体生存率显著低于miR-29b高表达组(Log-rankP<0.05)。miR-371低表达组、高表达组平均生存期分别为(19.0±3.9)、(27.5±4.1)个月,miR-371低表达组患者的累积总体生存率显著高于miR-371高表达组(Log-rankP<0.05)。

2.5单因素及多因素COX回归分析影响中晚期HCC患者预后的因素 以中晚期HCC患者预后为因变量,赋值(0=生存,1=死亡,t=生存期)并建立COX比例风险回归模型。回归过程采用逐步后退法,以进行自变量的选择和剔除,设定α剔除=0.10,α入选=0.05。将性别(赋值:0=男,1=女)、年龄(赋值:0=≤60岁,1=>60岁)、Child-Pugh分级(赋值:0=A级,1=B级)、KPS评分(赋值:0=≤90分,1=>90分)、术前AFP(赋值:0=<400 μg/L,1=≥400 μg/L)、肿瘤最大径(赋值:0=<5 cm,1=>5 cm)、病灶个数(赋值:0=1个,1=≥2个)、miR-29b(赋值:0=高表达,1=低表达)、miR-371(赋值:0=低表达,1=高表达)引入回归方程,结果显示,病灶个数、肿瘤最大径、miR-29b、miR-371是影响HCC患者生存预后的因素(P<0.05),见表4。将上述单因素分析结果中P<0.10的4个因素作为自变量,多因素COX回归分析结果显示,病灶个数≥2个、肿瘤最大径>5 cm、miR-29b低表达、miR-371高表达均是影响HCC患者预后的独立危险因素(P<0.05)。见表5。

表4 HCC患者预后的单因素

表5 多因素COX回归分析影响HCC患者预后的因素

3 讨 论

HCC是原发性肝癌中最常见的类型,我国乙型肝炎患病率较高,HCC风险较高,每年发病例数约16万例,死亡例数约14万例,严重威胁人们的身体健康[11]。早期HCC通常可通过手术进行治愈性治疗,而对于中晚期HCC患者,即使经积极TACE等综合治疗后,肿瘤仍可发生复发转移,导致患者不良生存预后。因此,深入研究HCC肿瘤发生、发展的机制,寻找能够判断中晚期HCC患者预后的生物标志物,具有重要的临床价值。

miR-29b位于人类染色体7q32.3,其作为一种miRNA,能够结合到下游靶基因的3′-非编码区(3′UTR),降低靶基因信使RNA的稳定性,抑制下游基因表达。近年研究发现,miR-29b在乳腺癌及肺癌等恶性肿瘤中异常表达升高或降低,通过影响Wnt、AKT等信号通路,参与肿瘤的发生、发展[12]。本研究中,中晚期HCC患者血清miR-29b表达明显降低,并且与肝功能Child-Pugh分级、肿瘤最大径及肿瘤个数等临床病理特征有关,提示HCC中miR-29b的表达下调可能参与促进HCC的肿瘤进展。miR-29b的表达下调可能与上游长链非编码RNA(lncRNA)的表达调控有关。研究表明,lncRNA HCP5能够结合并抑制miR-29b的表达,继而促进DNA甲基转移酶3的表达,激活下游AKT信号通路,促进HCC患者肿瘤细胞的增殖及转移[13]。有研究发现,miR-29b的表达能够抑制基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达,miR-29b的表达下调导致肿瘤细胞MMP-9的表达显著增加,促进肿瘤细胞的侵袭和转移[14]。因此,HCC中miR-29b可能作为一种抑癌因子,发挥肿瘤抑制的功能。本研究结果证实,miR-29b低表达的HCC患者生存预后较差,是患者不良预后的独立因素。有学者发现,肝癌细胞中miR-29b的表达下调促进自噬相关基因LC3B的表达,诱导肿瘤细胞对化疗药物及靶向药物索拉非尼的耐药性形成[15]。亦有报道显示,miR-29b的表达升高能够增加骨肉瘤细胞对化疗药物的敏感性,增强化疗疗效[14]。因此,HCC中miR-29b的表达降低可能通过降低肿瘤细胞对化疗药物的治疗的敏感性,导致患者不良预后。临床上可根据血清miR-29b水平对HCC患者的临床预后进行评估,并采取相应的治疗和随访方案,以改善患者的生存质量及预后。

miR-371位于人类染色体19q13.42,其作为一种miRNA,参与调节细胞增殖、分化、凋亡和衰老等生物学过程。研究表明,miR-371在胃癌及胰腺癌等肿瘤患者中表达显著升高,其通过促进细胞周期G1/S期的转换促进肿瘤细胞的恶性增殖[16]。本研究结果发现,HCC患者血清miR-371表达显著升高,并且与Child-Pugh分级、肿瘤最大径及肿瘤个数有关,表明miR-371的表达升高参与促进中晚期HCC患者的肿瘤进展。分析其原因,肿瘤miR-371表达上调与染色体重排有关。研究发现,19q13.4染色体重排的肿瘤细胞中RNA聚合酶Ⅱ片段表达增加,导致miR-371基因簇过度表达[17]。此外,miR-371能够通过抑制抑癌基因磷酸酶和张力蛋白同系物的表达,促进肝肿瘤细胞的增殖及迁移转移能力[6]。因此,HCC中miR-371可能作为一种肿瘤促进因子,发挥促进HCC肿瘤进展的作用。本研究发现,miR-371高表达的HCC患者生存预后较差,是患者不良预后的独立危险因素,提示临床医生可根据患者血清miR-371水平对患者的临床预后进行评估,指导临床治疗。

目前研究认为,HCC的发生发展与肿瘤微环境的改变密切相关,肿瘤微环境中Th1/Th2型细胞因子平衡失调不仅直接促进HCC的肿瘤进展,还能通过抑制微环境中免疫细胞的正常功能,发挥肿瘤促进作用[18]。IL-2和IFN-γ是肿瘤微环境中Th1型细胞因子,能够通过增强肿瘤杀伤T淋巴细胞的肿瘤杀伤功能,发挥抗肿瘤效应,IL-4和IL-10属于Th2型细胞因子,能够通过促进巨噬细胞向M2型转化,介导肿瘤细胞免疫逃逸,发挥肿瘤促进效应[19]。本研究中,HCC组患者血清IFN-γ、IL-2水平降低,而IL-4、IL-10水平明显升高,提示中晚期HCC患者存在Th1/Th2型细胞因子漂移的现象,患者机体处于免疫抑制的状态。相关性分析发现,血清miR-29b、miR-371表达与Th1/Th2型细胞因子均具有相关性,表明miR-29b、miR-371可能通过影响Th1/Th2型细胞因子漂移,参与促进HCC进展。研究表明,IFN-γ表达受miR-29b的表达调控,肿瘤中miR-29b表达降低导致CD4+T淋巴细胞DNA的高甲基化,抑制IFN-γ等Th1型细胞因子的表达及分泌[20]。有研究发现,miR-371的表达升高能够促进CD4+T淋巴细胞中Runt相关转录因子3的表达,抑制Th1型细胞因子的分泌,同时促进Th2型细胞因子的产生[8],Th2型细胞因子通过抑制机体抗肿瘤免疫功能,如抑制肿瘤杀伤性T淋巴细胞的肿瘤杀伤功能,促进肿瘤的转移[21]。

综上所述,中晚期HCC患者血清miR-29b水平降低,miR-371水平升高,二者表达与肝功能Child-Pugh分级、肿瘤最大径及肿瘤个数及Th1/Th2型细胞因子水平有关,二者可能通过影响HCC肿瘤免疫微环境中Th1/Th2型细胞因子的平衡状态,促进HCC进展。但本研究尚存在不足之处,样本量有限,并且未对中晚期HCC患者治疗前后血清miR-29b、miR-371水平动态变化进行监测,因此,有待今后扩大样本量进行深入研究。