lncRNA FIRRE靶向miR-490-3p对H2O2诱导的心肌细胞损伤的影响

张雅文,韩伟东,赵 青

1.青岛大学附属医院电生理科,山东青岛 266071;2.山东大学附属威海市立医院电生理科,山东威海 264200;3.青岛大学附属医院平度院区急诊科,山东青岛266700;4.青岛大学附属医院心内科,山东青岛 266071

在病理状态下,心肌细胞氧化损伤和细胞凋亡是心血管疾病如心肌梗死、心力衰竭的重要发病机制[1]。以往研究发现,长链非编码RNA(lncRNA)参与调控心肌细胞凋亡、氧化应激和炎症反应等过程,可作为心血管疾病的治疗靶点[2]。lncRNA FIRRE作为一种lncRNA,参与多种疾病的发展进程。有研究显示,lncRNA FIRRE在双侧慢性缩窄性损伤小鼠及脂多糖(LPS)诱导小鼠原代小胶质细胞中均表达上调,下调lncRNA FIRRE可抑制LPS诱导小鼠原代小胶质细胞分泌促炎细胞因子,缓解小鼠神经性疼痛[3];lncRNA FIRRE可通过激活NF-κB信号通路促进NLRP3炎症小体转录,从而促进氧糖剥夺/复氧诱导的脑小胶质细胞损伤,可作为缺血性中风的新治疗靶点[4]。然而,lncRNA FIRRE对心肌细胞氧化损伤和凋亡的影响还未知。生物信息学预测显示,lncRNA FIRRE与miR-490-3p有相互结合的位点,miR-490-3p是lncRNA FIRRE的潜在靶基因。研究显示,miR-490-3p在心肌缺血再灌注损伤中下调,通过上调其表达可减小梗死面积,减轻心肌缺血再灌注损伤[5]。基于以上研究,推测lncRNA FIRRE可能通过靶向调节miR-490-3p参与心肌损伤。因此,本研究采用过氧化氢(H2O2)诱导建立心肌细胞H9c2损伤模型,探讨lncRNA FIRRE能否靶向miR-490-3p对H2O2诱导的H9c2细胞凋亡和氧化应激的影响。

1 材料与方法

1.1材料 H9c2细胞购自武汉普诺赛生命公司,胎牛血清(FBS)购自浙江天杭生物科技有限公司,DMEM培养液、双荧光素酶检测试剂盒、凋亡试剂盒购自北京索莱宝科技,LipofectamineTM2000试剂盒购自美国Invitrogen公司,RNA抽提试剂盒、PCR试剂盒、逆转录试剂盒购自大连宝生物;引物、si-lncRNA FIRRE、si-NC、miR-490-3p、anti-miR-490-3p、anti-miR-NC、miR-NC由上海生工;乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD),活性氧(ROS)试剂盒购自南京建成生物工程研究所;裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved-caspase-3)购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2方法

1.2.1细胞转染和分组 复苏H9c2细胞,用含10% FBS的DMEM培养液置于CO2培养箱。将对数期H9c2细胞接种至6孔板中,用LipofectamineTM2000脂质体法,转染si-NC、si-lncRNA FIRRE、miR-NC、miR-490-3p mimics、共转染si-lncRNA FIRRE与anti-miR-NC、si-lncRNA FIRRE与anti-miR-490-3p。转染48 h后的细胞均用含200 μmol/L[6]H2O2的培养液处理24 h,依次记为H2O2+si-NC组、H2O2+si-lncRNA FIRRE组、H2O2+miR-NC组、H2O2+miR-490-3p组、H2O2+si-lncRNA FIRRE+anti-miR-NC组、H2O2+si-lncRNA FIRRE+anti-miR-490-3p组。另设置对照组(未转染的H9c2细胞常规培养液培养24 h)和H2O2组(未转染的H9c2细胞用含200 μmol/L H2O2的培养液处理24 h)。然后收集细胞用于后续实验。

1.2.2实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测lncRNA FIRRE和miR-490-3p表达 用RNA抽提试剂盒提取各组细胞中总RNA,逆转录为cDNA后,行PCR扩增。引物序列:lncRNA FIRRE正向引物为5′-CGTAGGCGCTAGGAAGGCGG-3′,反向引物为5′-CGTGCTAGGAATAGCTCGAGC-3′;miR-490-3p正向引物为5′-CGTGGATCCTTCTTCAACCAA CGGTGGTG-3′,反向引物为5′-CCAGAATTCAAAGCAGGAAGAGTAAGACTTCC-3′。采用2-ΔΔCt法计算lncRNA FIRRE相对GAPDH、miR-490-3p相对U6的表达量。

1.2.3CCK-8法检测细胞增殖抑制率 细胞接种至96孔板中(5.0×104个/孔),按照1.2.1设置分组。培养结束,每孔加10 μL CCK-8,孵育2 h,采用酶标仪检测450 nm处吸光度(A)值。

1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡 细胞接种至6孔板中,按照上述1.2.1设置分组。培养结束收集各组细胞,利用膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)试剂盒,上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.5试剂盒检测MDA、LDH、ROS水平和SOD活性 细胞接种至6孔板中,按照1.2.1设置分组。培养结束后,收集各组细胞培养上清液,利用LDH、MDA、SOD试剂盒,检测上清液中LDH、MDA、ROS水平和SOD活性。

1.2.6双荧光素酶报告基因实验 扩增含miR-490-3p结合位点的lncRNA FIRRE核苷酸序列,构建lncRNA FIRRE野生型(WT-lncRNA FIRRE)荧光素酶报告基因载体;将结合位点突变后,插入pGL3载体,构建lncRNA FIRRE突变型(MUT-lncRNA FIRRE)荧光素酶报告基因载体,此过程由上海生工完成。用LipofectamineTM2000脂质体法,分别共转染WT-lncRNA FIRRE、MUT-lncRNA FIRRE与miR-NC或miR-490-3p mimic、与miR-NC共转染细胞,利用双荧光素酶活性检测试剂盒检测荧光素酶活性。

1.2.7免疫印迹法(Western blotting)检测Cleaved-caspase-3蛋白表达水平 以β-actin为内参,采用免疫印迹法检测Cleaved-caspase-3的蛋白表达水平,统计蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1沉默lncRNA FIRRE对H2O2诱导的心肌细胞凋亡、增殖和miR-490-3p水平的影响 H2O2组H9c2细胞lncRNA FIRRE相对表达量高于con组,miR-490-3p水平低于con组(P<0.05),H9c2细胞增殖抑制率、凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平均高于con组(P<0.05)。H2O2+si-lncRNA FIRRE组H9c2细胞中lncRNA FIRRE表达量低于H2O2+si-NC组,miR-490-3p水平高于H2O2+si-NC组(P<0.05),H9c2细胞增殖抑制率、凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平均低于H2O2+si-NC组(P<0.05)。H2O2组与H2O2+si-NC组各检测指标比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见图1、表1。

注:A为细胞凋亡检测;B为凋亡率统计;C为Western blotting蛋白检测;D为蛋白检测结果统计;与con组相比,aP<0.05;与H2O2组相比,bP<0.05;与H2O2+si-lncRNA FIRRE组相比,cP<0.05。

表1 沉默lncRNA FIRRE对H2O2诱导的H9c2细胞增殖和miR-490-3p水平的影响

2.2沉默lncRNA FIRRE对H2O2诱导的心肌细胞氧化应激的影响 H2O2组H9c2细胞培养上清液中LDH水平和细胞中MDA、ROS水平均高于con组(P<0.05),细胞中SOD活性低于con组(P<0.05)。H2O2+si-lncRNA FIRRE组H9c2细胞培养上清液中LDH水平和细胞中MDA、ROS水平均低于H2O2+si-NC组(P<0.05),细胞中SOD活性高于H2O2+si-NC组(P<0.05)。见表2。

表2 沉默lncRNA FIRRE对H2O2诱导的H9c2氧化应激的检测

2.3lncRNA FIRRE靶向调控miR-490-3p表达 DIANA Tool靶基因在线软件、StarBase数据库和TargetScan数据库预测显示的lncRNA FIRRE与miR-490-3p结合位点,见图2。与WT-lncRNA FIRRE与miR-NC共转染组相比,WT-lncRNA FIRRE与miR-490-3p mimics共转染的H9c2细胞荧光素酶活性降低,差异有统计学意义(t=15.735,P<0.05);与MUT-lncRNA FIRRE与miR-NC共转染组相比,MUT-lncRNA FIRRE与miR-490-3p mimics共转染的H9c2细胞荧光素酶活性无明显变化,差异无统计学意义(t=1.040,P=0.314),见表3。转染si-lncRNA FIRRE的H9c2细胞中miR-490-3p的表达量(2.89±0.16)显著高于转染si-NC的细胞(1.00±0.00),差异有统计学意义(t=35.438,P<0.05)。

图2 lncRNA FIRRE和miR-490-3p核苷酸的互补序列

表3 lncRNA FIRRE与miR-490-3p的双荧光素酶检测结果

2.4过表达miR-490-3p对H2O2诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激的影响 H2O2+miR-490-3p组H9c2细胞中miR-490-3p表达量和SOD活性均高于H2O2+miR-NC组(P<0.05),细胞抑制率、凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白水平、细胞培养上清液中LDH水平和细胞中MDA、ROS水平均低于H2O2+miR-NC组(P<0.05)。见表4、图3。

注:A为细胞凋亡检测;B为凋亡率统计;C为Western blotting蛋白检测;D为蛋白检测结果统计;与H2O2+miR-NC组相比,aP<0.05。

表4 过表达miR-490-3p对H2O2诱导的H9c2细胞凋亡和氧化应激的影响

2.5下调miR-490-3p逆转沉默lncRNA FIRRE对H2O2诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激的影响 H2O2+si-lncRNA FIRRE+anti-miR-490-3p组H9c2细胞中miR-490-3p表达量和SOD活性均低于H2O2+si-lncRNA FIRRE+anti-miR-NC组(P<0.05),细胞抑制率、凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白水平、细胞培养上清液中LDH水平和细胞中MDA、ROS水平均高于H2O2+si-lncRNA FIRRE+anti-miR-NC组(P<0.05)。见表5、图4。

表5 下调miR-490-3p逆转沉默lncRNA FIRRE对H2O2诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激的影响

注:A为细胞凋亡检测;B为凋亡率统计;C为Western blotting蛋白检测;D为蛋白检测结果统计;与H2O2+si-lncRNA FIRRE+anti-miR-NC组相比,aP<0.05。

3 讨 论

心血管疾病严重威胁人类生命健康,近年来其发病率逐年升高[7]。心肌细胞损伤如细胞氧化应激、炎症反应及细胞凋亡是心血管疾病发生发展的重要原因[8],通过探究心肌细胞损伤的分子机制,可为心血管疾病的治疗提供分子靶点。lncRNA在真核生物中广泛存在,其可通过竞争性吸附miRNA调控miRNA靶基因的表达发挥调控作用[9]。报道显示,TTTY15、FTX和SNHG1等lncRNA与心肌细胞损伤有关[10-12]。lncRNA FIRRE已被报道在多种疾病的发生、发展中发挥作用,如在LPS诱导小胶质细胞中,lncRNA FIRRE水平升高,下调其表达可抑制促炎细胞因子分泌,缓解神经性疼痛[3];在氧糖剥夺/复氧诱导小胶质细胞中,lncRNA FIRRE的高表达可激活NF-κB信号通路,加剧脑小胶质细胞损伤[4]。在本研究中,H2O2处理后,细胞中lncRNA FIRRE表达量升高,通过沉默lncRNA FIRRE表达发现,沉默lncRNA FIRRE降低了H2O2诱导的H9c2增殖抑制率、凋亡率及Cleaved-caspase-3蛋白水平,这说明沉默lncRNA FIRRE对H2O2诱导的H9c2损伤具有保护作用。

H2O2可诱导心肌细胞生成大量ROS,同时降低细胞内SOD等抗氧化酶的活性,导致细胞膜上的脂质发生过氧化,改变细胞膜通透性,进而使细胞结构和功能破坏,诱导细胞凋亡的发生[13]。MDA是细胞脂质过氧化产物之一,其水平高低可反应细胞氧化损伤程度[14]。LDH是一种糖酵解酶,其存在与细胞质中。当细胞膜通透性增加时,LDH被释放进入细胞外液中,因此,细胞培养上清液中LDH水平可间接反映细胞受损程度[15]。本研究结果显示,沉默lncRNA FIRRE降低了H2O2诱导的H9c2培养上清液中LDH水平及细胞中MDA,同时提高了SOD的活性,这说明沉默lncRNA FIRRE抑制了H2O2诱导的H9c2氧化损伤。

本研究采用DIANA Tool靶基因在线软件、StarBase数据库和Targetscan数据库对lncRNA FIRRE的靶基因进行了预测,最终得出共同的靶基因miR-490-3p;双荧光素实验证实了lncRNA FIRRE可靶向结合并负调控miR-490-3p。研究显示,动脉粥样硬化患者血清及氧化低密度脂蛋白刺激的人主动脉血管平滑肌细胞(HA-VSMC)中miR-490-3p的表达下调,上调miR-490-3p可靶向抑制高迁移率族蛋白1抑制HA-VSMC增殖和迁移[16]。在心肌缺血再灌注损伤中,miR-490-3p水平降低,其过表达可减小梗死面积,减轻心肌缺血再灌注损伤[5]。在本研究中,H2O2降低H9c2中miR-490-3p表达,过表达miR-490-3p对H2O2诱导的H9c2细胞凋亡和氧化损伤具有明显的抑制作用,提示miR-490-3p可作为减轻心肌细胞损伤的分子靶点。本研究还发现,下调miR-490-3p逆转了沉默lncRNA FIRRE对H2O2诱导的H9c2细胞凋亡和氧化损伤的抑制作用,提示沉默lncRNA FIRRE通过靶向上调miR-490-3p的表达来抑制H2O2诱导的H9c2细胞凋亡和氧化损伤。

综上所述,H2O2促进了心肌细胞H9c2中lncRNA FIRRE的表达,而抑制了miR-490-3p表达;沉默lncRNA FIRRE抑制了H2O2诱导的H9c2细胞凋亡和氧化损伤,作用机制可能与靶向负调控miR-490-3p有关。在未来的研究中将对miR-490-3p的下游靶基因进行探讨以进一步完善lncRNA FIRRE的作用机制研究。