基于网络药理学及分子对接探讨益气活血方治疗深静脉血栓形成的作用机制*

秦晓慧，罗 丹，张 力

1 广西中医药大学研究生院,广西 南宁 530001； 2 广西中医药大学第一附属医院,广西 南宁 530023

深静脉血栓形成（deep vein thrombosis，DVT）是指血液在深静脉腔内不正常凝结，阻塞管腔而引起的静脉回流障碍，多见于大手术或严重创伤、长期卧床、肢体制动、肿瘤患者等。DVT 急性期易并发严重的致死性肺栓塞，慢性期由于静脉瓣膜功能受损易发生血栓，危及患者的生命质量与安全［1-2］。目前认为DVT的主要原因是静脉血流滞缓、静脉壁损伤和血液高凝状态［3］，现代医学治疗方法主要有抗凝、溶栓、手术取栓、放置下腔静脉滤器等［4］。

深静脉血栓属中医学“股肿”“瘀血流注”及“脉痹”等范畴［5］，其病位在血脉，脉络血瘀贯穿于DVT 的始终［6］。中医药治疗DVT 具有综合调控的优势，中药组方中多种成分可通过多途径、多靶点协同发挥复杂生物学作用。益气活血方是院内制剂，遵《医林改错》“气虚血必瘀”之旨，在血府逐瘀汤的基础上加减化裁而成。本方由桃仁、红花、生地黄、川芎、当归、赤芍、柴胡、枳壳、甘草、黄芪、水蛭、牛膝等药味组成，有益气化瘀、活血通脉之效，临床上用于治疗DVT，在溶栓、抗凝、保护血管内膜、减轻血栓形成后炎症反应等方面收效良好［7-8］，且安全性高，患者依从性好，在临床治疗DVT 中逐渐得到推广应用［9］。本文基于网络药理学的方法，对益气活血方的有效活性成分及其治疗DVT 的潜在作用靶点、信号通路进行预测，并采用分子对接技术进行评估验证，为益气活血方后续临床及实验研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 益气活血方活性成分和靶点筛选利用中药系统药理学分析平台（TCMSP，https：//www.tcmsp-e.com），以“黄芪”“甘草”“枳壳”“柴胡”“牛膝”“赤芍”“川芎”“当归”“生地黄”“红花”“桃仁”为关键词，进行检索，设定参数口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18进行初步筛选，获得相应药物的有效活性成分；在数据库中输入化合物成分，获得益气活血方中化合物成分对应的靶点。由于TCMSP数据库未收录水蛭，所以以“水蛭”为关键词，通过中药综合数据库（TCMID，http：//www.megabionet.org/tcmid/）搜集其成分，在Pubchem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）中根据成分名称查询相应的InChIKey，将得到的InChIKey通过TCMSP 数据库进行靶点提取。使用Uniprot蛋白质数据库（http：//www.uniprot.org），把筛选的靶点规范为人源（Homo sapiens）的标准因，得到其Gene ID作为靶点标准化名称。

1.2 DVT 相关靶点筛选使用GeneCards 数据库（https：//www. genecards. org）以“deep vein thrombosis”为关键词进行检索，获得疾病相关靶点。

1.3 益气活血方-DVT 潜在交集靶点的获取将收集到的药物和疾病的相关靶点上传至Venny2.1在线软件作图工具平台（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），在线得到两者的交集，作为药物-疾病潜在交集靶点。

1.4 潜在交集靶点的相互作用网络构建及分析将“1.3”项所得的潜在交集靶点输入到STRING 数据库（https：//www.string-db.org）中进行检索，物种来源选择“Homo sapiens”，在设定中将互作分数值设置为最高置信度0.9，隐藏网络中断开的节点，获取靶点互作的网络关系数据，绘制蛋白-蛋白相互作用网络（Protein-protein interaction，PPI）。

1.5 GO、KEGG 富集分析将益气活血方治疗DVT的潜在靶点上传至生物学信息注释数据库（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/），在线进行基因本体论（gene ontology，GO）。生物学过程富集分析和基于京都基因与京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）代谢通路富集分析。

1.6 网络模型的构建及分析将益气活血方中药物的活性成分，以及药物-疾病潜在作用靶点导入Cytoscape 3.7.2 软件中，构建“药物-有效成分-靶点-通路”相互作用网络图。

1.7 分子对接验证从PubChem 数据库、PDB 数据库（http：//www.rcsb.org/）检索并下载核心化合物和关键作用靶点的3D 结构。通过PyMOL 软件，对核心活性成分和关键作用靶点的3D 结构进行去水、加氢，转换成pdbqt 格式。由autodock vina 1.1.2 软件完成分子对接分析。最后运用PyMOL软件将对接结果进行可视化分析。

2 结果

2.1 药物靶点与疾病靶点的筛选结果及处理通过TCMSP、TCMID、Pubchem 数据库，按照“1.1”项的方法获得益气活血方的有效成分，把它们对应的靶点输入UniProt 数据库，删除去重后，最终得到155个潜在活性成分，筛选出246个药物靶点。以“deep vein thrombosis”为关键词在Gene Cards 数据库进行检索，获得疾病相关靶点1977 个。使用Venny2.1 在线软件作图工具平台对中药靶点与疾病靶点取交集，获得二者交集靶点162个。见图1。

图1 益气活血方-DVT靶点韦恩图

2.2 构建药物-疾病潜在作用靶点蛋白-蛋白PPl关键靶点提取利用Cytoscape 3.7.2 软件，导入“2.1”项所得的药物-疾病潜在作用靶点162个，构建药物-疾病PPI网络。见图2。

图2 益气活血方-DVT靶点PPI网络

从图中可知，益气活血方不仅作用于多靶点，还会通过影响靶点之间的潜在作用关系，共同发挥治疗作用。

在药物-PPI 网络中，共有162 个节点，750 条边，Degree 平均值为9.26。Degree 为节点的自由度，表示网络中与该节点直接作用的节点数目，自由度越大则生物学重要性越强。本文提取了自由度前30的潜在作用靶点，以获得药物-疾病PPI网络中的关键靶点，可视化结果如见图3。

图3 药物-疾病PPI网络中的关键靶点

研究发现，信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、表皮生长因子受体等作用靶点在网络中起到关键性作用。

2.3 富集分析

2.3.1 GO 富集分析 为进一步探究益气活血方中有效成分靶点的基因功能，基于David 数据库对其进行GO 功能富集分析，共获得P＜0.05 的条目2577 条，包括：1）生物过程（Biological process，BP）2304 条。主要包括氧化应激反应、对脂多糖的反应、细胞对化学应激的反应、调节DNA 结合转录因子的活性、对营养水平的反应、凋亡信号通路调控等方面。2）细胞组分（cellular component，CC）59 条。主要在膜筏、膜微区、膜区、囊腔、胞质囊腔、分泌颗粒腔、小窝、核染色质等靶点富集相对集中。3）分子功能（molecular function，MF）159条。

将所得GO 富集分析进可视化处理，取各项靶点的前30个作成条形图，结果如图4—6所示。其中，p.adjust 代表富集的显著性，颜色越红则显著性越高。

图4 药物-疾病的GO富集分析图（BP）

图5 药物-疾病的GO富集分析图（CC）

图6 药物-疾病的GO富集分析图（MF）

2.3.2 KEGG 富集分析 通过David 数据库，对益气活血方的靶点在信号通路中的作用进行KEGG通路富集分析。KEGG分析结果表明，162个相关靶点共参与了168 条信号通路过程，包括PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路、糖基化终末产物/糖基化终末产物受体（advanced glycation end products/receptor for advanced glycation end products，AGE/RAGE）信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、白细胞介素17（interleukin-17，IL-17）信号通路、缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信号通路、C 型凝集素受体信号通路、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药性及多种癌症相关通路等。筛选排名前30 位的信号通路，采用Omic-Share软件绘制通路信息图，结果如图7所示。其中，气泡图节点大小和颜色由相关联基因的数量和P值决定，节点从小到大反映了相关联基因的数量由少到多，颜色从蓝色转变红色反映了P值逐渐减小。见图7。

图7 前30位的信号通路信息图

2.4 药物-有效成分-靶点-通路网络的构建采用Cytoscape 3.7.2 构建药物-成分-靶点-通路网络，结果如图8 所示，圆形节点代表益气活血方中的中药，六边形节点代表药物有效成分，V 型节点代表潜在作用靶点，三角形代表信号通路。药物-成分-靶点-通路网络共由359 个节点组成，包含2373 条边。研究发现该方的核心成分为槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、异鼠李素、木犀草素等，可能通过作用于STAT3、MAPK1、MAPK3、VEGFA、IL-6等靶点和PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路、HIF-1 信号通路、白细胞介素17 信号通路等达到治疗DVT的作用。

2.5 分子对接从Pubchem和PDB数据库分别获取核心化合物的3D结构和关键作用靶点的晶体结构。其中，MAPK1 的PDB ID 为：4G6O；VEGFA 的PDB ID为：3QTK。将核心活性化合物和关键作用靶点的3D结构加氢去水去配体，再通过autodock vina1.1.2软件进行分子对接分析。结果表明，益气活血方的核心活性成分与MAPK1、VEGFA 的分子对接结合能均远小于-5 kcal/mol；与MAPK1 结合能最低的化合物分别为槲皮素（结合能为-8.0 kcal/mol）、异鼠李素（结合能为-7.9k cal/mol）、山柰酚（结合能为-7.9 kcal/mol）、β-谷甾醇（结合能为-6.8 kcal/mol）。与VEGFA结合能最低的化合物分别为槲皮素（结合能为-8.5 kcal/mol）、异鼠李素（结合能为-8.5 kcal/mol）、山柰酚（结合能为-8.1 kcal/mol）、β-谷甾醇（结合能为-7.6 kcal/mol）。结果表明：槲皮素、β-谷甾醇、异鼠李素、山柰酚与潜在靶点高效结合，结合能低，构象稳定，相应的结果见图9、表1。

图9 分子对接示意图

3 讨论

《金匮要略》提出“血不利则为水”，张景岳认为：“凡治肿者，必先治水；治水者，必先治气。”《医林改错》中指出“气虚血必瘀”，故本病基本病机为气虚血瘀，瘀阻脉络，根据“气为血之帅，血为气之母”的理论，气能生血、摄血、行血，调畅气机，故治宜益气祛瘀、活血通脉。益气活血方以血府逐瘀汤为基础加减补气、破瘀之品，共奏益气活血通脉之效。

3.1 益气活血方的有效成分通过“药物-有效成分-靶点-通路网络”图可知槲皮素、β-谷甾醇、异鼠李素、山柰酚、木犀草素等为益气活血方治疗DVT 的重要有效成分。槲皮素不仅能降低血小板的高度聚集、减少血小板颗粒的胞外分泌，还可以抑制凝血酶和人内皮细胞的激活因子X 的活性，减少纤维蛋白凝块和血液凝块的形成，起到抗凝和抗血栓作用［10-12］。β-谷甾醇主要有抗氧化、抗炎、降血脂和抗肿瘤等作用［13］，能通过降低毛细血管通透性起到抗炎作用，从而保护血管［14］；β-谷甾醇具有溶栓活性，在体内能够发挥抗凝活性，有助于预防血栓形成［15］。异鼠李素具有抗炎、抗氧化、抗血栓、保护血管内皮、抗肿瘤等广泛的药理作用［16-17］，异鼠李素作用核因子κB、信号转导及转录激活因子1 而影响诱导一氧化氮合酶的活性，起到抗炎作用，从而保护血管内皮的完整性，还能抑制血小板聚集及血小板激活时必要的活性胶原成分形成，起到抑制血小板凝集及抗血栓的作用［18］。山柰酚具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等功效［19］，能够抑制凝血酶活性、抑制纤维蛋白聚合物的形成，还能使凝血时间延长，从而减少或防止血栓形成［20］。

3.2 作用关键靶点PPI 网络图提示益气活血方治疗DVT 的主要靶蛋白有STAT3、MAPK1、MAPK3、VEGFA、IL-6 等。STAT3 可调节胶原诱导的血小板活化和聚集，有可能使血小板在炎症条件下过度活跃，如IL-6 可增强胶原诱导的STAT3 激活［21］。STAT3 磷酸化可调节TXA2 受体活性，从而调控血小板的活化［22］。MAPK1 和MAPK3 可通过调控炎症细胞增殖、分化和凋亡，减少血管损伤［23-24］，此外二者也是VEGF 信号通路中的关键靶点，可参与血管内皮细胞的分裂和迁徙，促进血管生成［25］。VEGFA 是最主要的血管内皮生长因子，可调控内皮祖细胞［26］，促进受损的血管内膜修复和血管生成［27］。IL-6 是一种促炎和免疫调节因子；DVT 中IL-6 表达增加，MiR-338-5p 可抑制其表达从而减轻炎症，从而有效减少血栓大小和重量，并达到保护血管内皮细胞的功能［28］；研究表明血栓溶解过程中IL-6 可以诱导巨噬细胞表达CCL2，从而促进巨噬细胞的浸润，参与血栓溶解［29］。

3.3 信号通路KEGG 富集分析结果表明，益气活血方治疗DVT 主要与PI3K/Akt 通路、MAPK 通路、TNF通路、IL-17通路、HIF-1通路等密切相关。PI3K/Akt 信号通路与细胞生命活动密切相关，主要发挥促进增殖、保护、抗凋亡的作用［30］。PI3K/Akt信号通路可通过上调炎症细胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-8 等 的蛋白表达，从而促进DVT 的形成［31］。MiR-9-5p 通过介导PI3K/Akt 自噬途径促进EPC 增殖、迁移和血管生成，从而促进血栓溶解，加速血栓再通［32］。MAPK 信号通路是调控细胞增殖、转录、分化和凋亡的基本信号通路［33］。PDK1可通过调节MAPK 通路中Raf1 的激活来调控血小板血栓素的生成和血栓形成［34］。抗β2GPI/β2GPI复合物可诱导血小板活化，并通过p38MAPK 途径促进血栓形成［35］。丹皮酚通过ERK1/2MAPK 信号通路诱导VEGF165 促进血栓再通［36］。TNF-α 可激活靶细胞刺激组织因子的生成和释放，抑制纤溶系统相关因子的合成，并诱导细胞黏附因子的合成与释放［37］。IL-17可介导自身免疫和炎症反应［38］，它作为免疫应答介质，可损伤血管内皮细胞［39］。IL-17 和TNF-α 相结合时可增加血小板聚集，抑制抗凝作用，导致血栓形成［40］。缺氧条件下，缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）表达升高，能加快下游相关基因的转录和表达，介导血管生成［41-42］。

本研究结果表明，益气活血方中的槲皮素、β-谷甾醇、异鼠李素、山柰酚等主要活性成分，可能作用于STAT3、MAPK1、MAPK3、VEGF-A、IL-6 等多个靶点，干预PI3K/Akt、MAPK、HIF-1、IL-17 等信号通路，从而调控机体炎症反应及免疫应答、影响血管内血小板聚集及血栓形成、减少细胞缺氧损伤、保护血管内皮，从而发挥治疗DVT的作用。