糖络宁通过外泌体调控IRE1α 诱导细胞凋亡的作用机制研究*

姚伟洁，李 潇，冯 欣△，许利平

1 首都医科大学附属北京妇产医院北京妇幼保健院，北京 100006；2 首都医科大学中医药学院中医络病研究北京市重点实验室，北京 100069

中药复方糖络宁（以下简称TLN）在临床上治疗糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）取得了很好的临床疗效［1-2］，前期实验发现，TLN 能够通过抑制雪旺细胞（schwann cells，SCs）中的IRE1α 表达，进而抑制内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ER stress）诱导的细胞凋亡，从而改善DPN［3］。外泌体是由不同细胞类型释放到细胞外空间的纳米囊泡，外泌体可以将功能分子转移至靶细胞，充当细胞间的通讯工具［4-5］。前期研究发现，TLN 能够通过增加血清外泌体中的miR-322，降低SCs 中IRE1α 的表达，并通过降低IRE1 依赖性衰解（IRE1-dependent decay，RIDD）活性，抑制细胞凋亡［6］。提示外泌体在TLN 抑制IRE1α 诱导的细胞凋亡中发挥了重要的通讯作用。

研究发现，ER stress 发生时，IRE1α 能够通过募集肿瘤坏死因子受体相关因子2（tumor necrosis factor receptor-associated factor 2，TRAF2），并与凋亡信号调节激酶1（apoptosis signal regulating kinase-1，ASK1）形成IRE1α-TRAF2-ASK1 复合体，进而激活c-Jun 氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）的磷酸化，诱导细胞凋亡［7］。尽管TLN 能够通过外泌体作为媒介抑制IRE1α 的表达，抑制细胞凋亡，但其能否进一步通过抑制JNK 从而抑制细胞凋亡，至今尚未有研究。因此本实验以SCs 作为研究对象，通过提取大鼠血清分泌的外泌体干预SCs，进而探讨TLN通过外泌体调控IRE1α 抑制细胞凋亡的机制，为糖络宁治疗DPN提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验药品链脲佐菌素（Sigma-Aldrich，批号：S0130）；澳洲胎牛血清（Gibco，批号：10099-141）；TRIzol 试 剂（Invitrogen，批 号：15596-025）；TransStart Tip Green qPCR SuperMix（AQ141-02，全式金）；TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（AT301-03，全式金）；高效RIPA 组织/细胞裂解液（索莱宝，批号：R0010-100）；蛋白Marker（Genstar，批号：M221）；超敏发光液（Millipore，批号：WBKLS0100）；BCA 测定试剂盒（博奥森，批号：C-0018）；小鼠单克隆p-JNK抗体，兔单克隆Bcl-2 抗体，兔单克隆Bax 抗体（Santa Cruz，批号：sc-6254，sc-7382，sc-7480）；兔单克隆Cytochrome C 抗体，兔多克隆Caspase-3抗体，小鼠单克隆β-actin抗体，兔单克隆TRAF6抗体（Abcam，批号：ab133504，ab13847，ab8226，ab33915）。

1.2 实验仪器3K15 型低温离心机（Sigma）；Mini-PROTEAN® Tetra 电 泳 槽（Bio-Rid）；小型Trans-Blot®转印槽（Bio-Rid）；371型二氧化碳培养箱（Thermo）；MLS-3020 型高压灭菌器（SANYO），CFX96TM实时荧光定量PCR 仪（Bio-Rid）；AC2-4E1型生物安全柜（ESCO）。

1.3 实验动物30只SD雄性大鼠，SPF级，6～8周龄，体质量（200±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK（京）2016-0006。饲养条件：动物饲养于SPF级饲养室，12 h/12 h昼夜交替、温度（23±2）℃、湿度（55±10）%，自由进食饮水。动物实验经首都医科大学伦理委员会批准，符合伦理要求。

1.4 实验细胞雪旺细胞，选购大鼠RSC96 细胞株，购买于American Type Culture Collection（ATCC），培养基为Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）完全培养基，含有4 mM 谷氨酰胺，25 mM 葡萄糖，1 mM 丙酮酸钠，1500 mg/L 碳酸氢钠，10% FBS 及1%青链霉素混合液。雪旺细胞的培养环境为37 ℃和5% CO2的培养箱。

1.5 实验方法

1.5.1 分组与给药 TLN 原药材经过2 次煎煮后，将2 次滤液合并，继续加热浓缩至膏状，于真空干燥器中干燥成粉末，临用前加蒸馏水溶解到10.9 g 生药/kg。造模方法参照文献［8］，30 只SD雄性大鼠适应性喂养1 周，分为空白组、模型组和TLN 组，每组10 只。其中模型组和TLN 组腹腔注射60 mg/kg 的链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）溶液，空白组则腹腔注射等量PBS溶液。1周后测定大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），FBG≥16.7 mmol/L 表明糖尿病模型建立成功。TLN 组灌胃给予10.9 g 生药/kg/d 的糖络宁溶液，持续给药12 周。空白组和模型组则给予10 mL/（kg·d）剂量的饮用水。最后一次给药1 h后将大鼠处死，腹主动脉取血，离心半径13.5 cm，3000 r/min 离心10 min 得到大鼠血清，-20 ℃冰箱保存备用。

1.5.2 外泌体的提取与内化作用 使用差速离心法提取大鼠血清中的外泌体。将大鼠血清依次300 g的离心力离心10 min，2000 g离心15 min，10 000 g离心30 min，收集上清液，继续70 000 g离心70 min，沉淀即为外泌体。使用PBS 溶解外泌体，用于后续研究。RSC96 细胞制成细胞悬液，并以4×105细胞/孔的数量接种于6 孔板中，于培养箱中放置过夜，待细胞贴壁后，分别将空白组、模型组和TLN 组大鼠血清分离的外泌体与细胞共培养24 h，收集细胞。

1.6 观察指标

1.6.1 Western blot 法测定蛋白表达 使用RIPA 裂解液提取RSC96 细胞中的蛋白，通过BCA蛋白定量试剂盒测定细胞蛋白浓度。将等量蛋白样本加入SDS-PAGE 凝胶中，并使用电泳分离蛋白，通过湿转系统将蛋白转运至0.45 μm PVDF膜上。使用5%脱脂奶粉室温封闭PVDF 膜2 h，随后加入相应一抗，4℃孵育过夜。吸弃一抗并加入相应二抗，室温孵育1 h 后，加入电化学发光试剂并置于凝胶成像系统中曝光形成图像。通过Image J软件计算蛋白样品的灰度值，计算蛋白的相对表达量，将β-actin 作为内标蛋白，结果以倍数的形式表示。一抗使用情况如下：小鼠单克隆β-actin抗体，兔单克隆TRAF6抗体，小鼠单克隆p-JNK抗体，兔单克隆Bcl-2抗体，兔单克隆Bax抗体，兔单克隆Cytochrome C抗体，兔多克隆Caspase-3抗体。

1.6.2 RT-PCR 法测定基因表达 使用TRIzol试剂提取各组RSC96细胞中的RNA，随后通过反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，cDNA继续通过SYBR预混系统和特异性引物进行RT-PCR 扩增，并通过计算2-△△Ct确定基因mRNA的相对表达水平。以β-actin作为内参，结果以倍数形式表示。引物使用情况见表1。

表1 引物序列

1.7 统计学方法通过SPSS 19.0 进行实验数据分析。计量资料以±s表示，多组独立样本间的比较使用One-Way ANOVA，非正态分布数据使用非参数检验方法，P＜0.05 表示组间差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TRAF2、p-JNK 及ASK1 蛋白表达与空白组相比，模型组TRAF2和p-JNK蛋白表达及ASK1 mRNA表达均显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，TLN组TRAF2 和p-JNK 蛋白表达及ASK1 mRNA 表达均显著降低（P＜0.01），表明TLN 能够通过外泌体抑制IRE1α-TRAF2-ASK1 复合体，进而抑制JNK 的磷酸化，抑制细胞凋亡。见图1、表2。

图1 各组TRAF2和p-JNK蛋白表达电泳图

2.2 Bcl-2和Bax蛋白表达与空白组比较，模型组Bcl-2表达显著降低，Bax表达显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，TLN组Bcl-2表达显著升高，Bax表达均显著降低（P＜0.01），表明TLN 能够通过外泌体抑制促凋亡蛋白Bax 的表达，促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达，从而抑制细胞凋亡。见图2、表2。

图2 各组Bcl-2和Bax蛋白表达电泳图

表2 各组TRAF2、p-JNK、Bcl-2、Bax蛋白及ASK1 mRNA表达比较（±s）

表2 各组TRAF2、p-JNK、Bcl-2、Bax蛋白及ASK1 mRNA表达比较（±s）

注：与空白组相比，aa表示P＜0.01，a表示P＜0.05；与模型组相比，bb表示P＜0.01

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2.3 Cyto C、cleaved-Caspase-3蛋白及Caspase-9 mRNA 表达与空白组比较，模型组Cyto C 和cleaved-Caspase-3 蛋白和Caspase-9 mRNA 表达显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，TLN组Cyto C和cleaved-Caspase-3蛋白和Caspase-9 mRNA表达显著降低（P＜0.01），表明TLN能够通过外泌体抑制Caspase-3诱导的细胞凋亡。见图3、表3。

图3 各组Cyto C和cleaved-Caspase-3蛋白表达电泳图

表3 各组大鼠Cyto C、cleaved-Caspase-3蛋白及Caspase-9 mRNA表达（±s）

表3 各组大鼠Cyto C、cleaved-Caspase-3蛋白及Caspase-9 mRNA表达（±s）

注：与空白组相比，aa表示P＜0.01，a表示P＜0.05；与模型组相比，bb表示P＜0.01，b表示P＜0.05

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3 讨论

外泌体是大小均一、直径约为30～100 nm、具有双层膜结构的球状或杯状囊泡，可由细胞分泌或存在于血液、尿液、唾液等体液中，其携带多种蛋白质、DNA、mRNA及miRNA等物质，通过与靶细胞结合，使靶细胞发生一系列的生物学效应［4-5］。研究发现，外泌体参与了糖尿病的发生过程，通过分离糖尿病及其并发症患者血清，并对血清中外泌体的miRNA进行测定，检测到多种miRNA的表达差异［9］。前期研究发现，TLN能够增加大鼠血清外泌体中的miR-322，进而降低SCs 中IRE1α 的表达，并通过降低RIDD 活性，抑制细胞凋亡［6］，提示外泌体在TLN 抑制IRE1α 诱导的细胞凋亡中发挥了重要的作用。

JNK是MAPK家族的成员之一，JNK信号通路参与了多种细胞凋亡的发生［10］。ER stress发生时，IRE1α 通过募集TRAF2，并与ASK1 形成IRE1α-TRAF2-ASK1复合体，从而激活JNK的磷酸化，诱导细胞凋亡［7，11］。本实验的结果显示，TLN 能够通过外泌体抑制IRE1α-TRAF2-ASK1 复合体，抑制JNK的磷酸化，进而抑制细胞凋亡。

JNK 还能够通过上调促凋亡因子Bax，并抑制抗凋亡因子Bcl-2，从而诱导细胞凋亡［12］。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的蛋白，二者相互抑制，Bcl-2表达被抑制后，Bax 构象变化并寡聚化，促进线粒体对促凋亡因子敏感性，并破坏ER 膜形态的完整性，Ca2+外流，促进细胞凋亡。本实验中，TLN 能够通过外泌体抑制JNK 的磷酸化，从而抑制Bax 表达，并促进Bcl-2的表达，抑制细胞凋亡。

JNK 同样可以破坏ER 膜形态的完整性，导致Ca2+外流至线粒体，从而增加线粒体外膜通透化（mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP），MOMP 则进一步使细胞色素C（Cytochrome C，Cyto C）从内膜释放至细胞质，上调Caspase-9 和Caspase-3 表达，诱导细胞凋亡。本实验中，TLN则能够通过外泌体抑制JNK的磷酸化，从而抑制Cyto C 表达，并进一步抑制Caspase-9和Caspase-3的表达，抑制细胞凋亡［10］。

综上所述，糖络宁能够通过外泌体为媒介，通过抑制IRE1α-TRAF2-ASK1 复合体，进而抑制JNK的磷酸化，然后分别通过进一步抑制促凋亡蛋白Bax 表达，促进抗凋亡蛋白Bcl-2 表达，以及抑制Cyto C、Caspase-9 和Caspase-3 的表达，从而抑制ER stress诱导的细胞凋亡。