基于网络药理学探讨补肺活血胶囊干预肺结节的作用机制*

吴戈平，胡薏敏，谢 纬，2，刘 玉，2，陈 生，2△

1 广州中医药大学第四临床医学院，广东 深圳 518000； 2 深圳市中医院呼吸与危重症医学科，广东 深圳 518000

近年来，临床上肺结节的检出率不断提高。《肺结节诊治中国专家共识（2018 年版）》将肺结节定义为直径≤3 cm 的孤立性或多发性的局灶性、类圆形肿块，其中孤立性结节多被肺实质包裹，不伴肺不张、肺门增大或胸腔积液［1］。中医典籍无“肺结节”“肺癌”的病名记载，有研究者认为本病应从“肺积”［2］论治，亦有从“痰”［3］“窠囊”［4］“络病”［5］论治本病者。陈生教授认为，肺结节应属“肺积”范畴，病因目前仍未完全明了，大致认为与外感因素、环境因素、职业因素、情志因素、饮食偏颇、宿有旧疾等相关。其病机是正气亏损，阴阳失调，六淫之邪乘虚入肺，或他脏病变，日久犯肺，邪滞于肺，导致肺脏功能失调，肺气阻郁，宣降失司，气机不利，血行受阻，津液失于输布，津聚为痰，痰凝气滞，瘀阻脉络，于是痰湿瘀毒胶结，日久形成肺部结节。

补肺活血胶囊（简称BFHX）由黄芪、赤芍、补骨脂组成，具有益气活血、补肺固肾的功效，临床可用于治疗肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病、重症肺炎等疾病［6-7］。临床治疗方面，手术切除是治疗恶性结节的首选方案，对于中低危结节仍以抗炎治疗和随访为主，缺乏有效的干预措施。然而HU等［8］通过多区域外显子组测序技术证实肿瘤演变是动态过程，可能随着时间进展而变化，这一发现充分说明肺结节全过程干预的有效性和必要性。中医中药可补充西医的不足之处，抑制肺结节倍增时间、降低转癌风险，缓解患者的焦虑，且经济便捷，应用前景广阔。本文拟通过网络药理学联合分子对接技术探讨BFHX 干预肺结节的作用机制，网络药理学有利于揭示中药复方多成分、多靶点的治疗或干预作用。

1 资料与方法

1.1 数据库本研究所需数据库及网址见表1。

表1 数据库及网址

1.2 BFHX活性成分及对应靶点筛选通过TCMSP及BATMAN-TCM 数据库，检索BFHX 组成“黄芪”“赤芍”“补骨脂”的化学成分，TCMSP 按照口服生物利用度≥30%且类药性≥0.18 设置参数，BATMAN-TCM中按照分数截至值≥20 且校正后，P值=0.05，设置参数筛选潜在的具有较高活性成分的化合物。

1.3 肺结节靶点获取在GeneCards、OMIM、CTD数据库中以“Pulmonary nodule”作为关键词对肺结节相关靶点进行检索，对评分高的靶点进行筛查，获得肺结节已知的可靠靶点，并筛选其中属人种的靶点，利用R 4.1.2语言将BFHX与肺结节的靶点取交集，绘制韦恩图，得到BFHX 干预肺结节的预测靶点。

1.4 BFHX 干预肺结节的网络构建及分析利用STRING 11.5 在线数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction networks，PPI），设置可信度＞0.99，将所获得的TSV文件导入Cytoscape 3.7.1 软件中，通过CytoNCA插件，以Degree 值为筛选条件，选择大于中位数的数据，进一步筛选BFHX 干预肺结节的核心靶点，构建药物成分-核心靶点-疾病网络。

1.5 核心靶点基因功能富集和通路富集分析通过R 4.1.2 语言的Bioconductor 软件包对BFHX干预肺结节的核心靶点进行GO 与KEGG 分析，GO生物分析通过生物途径（biology process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞组分（cellular component，CC）进行说明与注释。

1.6 药物成分-核心靶点分子对接验证利用分子对接模拟软件Autodock Vina 1.1.2 对黄芪-赤芍-补骨脂主要活性成分与肺结节核心靶点进行分子对接。通过PubChem 数据库获取黄芪-赤芍-补骨脂主要活性成分的2D结构，并利用Chem-Office 软件进行3D 结构转换。通过UniProt 蛋白数据库查找肺结节核心靶点的蛋白ID，并在PDB 数据库下载核心靶点蛋白的3D 结构，以PDB格式保存。利用Pymol 软件去除水分子及小分子配体。用AutoDockTools 1.5.7 软件对蛋白受体加氢，并将受体和配体的文件转换为PDBQT 格式。用vina 进行分子对接，找到蛋白受体和小分子配体和结合位点并计算该位点下的结合能（自由能）。结合能越低，配体与受体结合构象越稳定，分子与靶点蛋白作用越突出。

2 结果

2.1 BFHX 中活性成分与对应靶点在TCMSP 数据库（截至2021年11月）和BATMAN-TCM数据库（截至2021年11月）中筛选得到BFHX有效成分52个。

2.2 潜在作用靶点筛选结果各数据库收集的疾病靶点个数。详见表2。与Uniprot 数据库核对后，删去未经验证的，最终获得肺结节相关靶点7499 个。将疾病靶点与药物靶点经Venn 图取交集后共获得潜在靶点230个，见图1。构建“方药-成分-靶点”网络见图2。拓扑分析表明，BFHX中等鞣花酸、芍药苷、黄芩素、β-谷甾醇、谷甾醇、菠菜甾醇、豆甾醇、儿茶素、7-O-甲基异丙胺醇等成分作用的靶点最多，是BFHX干预肺结节的主要成分。

表2 各数据库收集的疾病靶点

图1 BFHX与肺结节交集靶点韦恩图

图2 方药-成分-靶点

2.3 PPl 网络构建结果将“2.2”项下的潜在作用靶点输入STRING 数据库，以置信度（combined score＞0.95）为标准，构建PPI 网络，见图3A，该网络包含156 个靶点和822 条对应关系，平均度（Degree）值10.53，最大值为68。靶点的度值越大，与其相连的靶点越多，在网络关系中越重要。应用CytoNCA 插件，相关参数均为默认，识别到PPI 网络的2 个子模块见图3B，并得出前10 个关键靶点。见表3，图3。

表3 BFHX干预肺结节的关键靶点

图3 A PPI网络

图3 B 核心靶点筛选

2.4 GO富集分析结果从DAVID数据库得到GO富集分析（P＜0.05）条目共2645 个，其中生物过程2305个，分子功能252个，细胞组分88个，对Q值排序后取前10名进行分析见图4。BFHX干预肺结节的潜在靶点主要参与CC 的有钾离子通道蛋白复合体、膜筏、膜微区等；参与MF 的包括配体-活化转录因子活性、电压-门控钾通道活性、脱氧核糖核酸-结合转录因子等；参与的主要BP 包括对脂多糖的反应、对金属离子的反应、对细菌源性分子的反应等，表明BFHX可以通过多种途径干预肺结节。

图4 GO富集分析

2.5 KEGG富集分析结果用R软件对共同靶点进行KEGG 信号通路富集，得到KEGG 通路（P＜0.05）168 条，阈值设置Q＜0.05，排序后取前30 名进行分析，见图5。KEGG富集最显著的15条通路分别是主要包括脂质相关通路、癌症相关通路、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、化学致癌-受体激活、炎症及感染性疾病相关通路、IL-17 信号通路、TNF信号通路等。结果显示，BFHX可能通过抗病毒、抗肿瘤、调节内分泌水平、抑制炎性反应、神经通路调节、蛋白质通路调节等方式干预肺结节。

图5 KEGG富集分析

2.6 药物成分-核心靶点分子对接分析选取BFHX 有效活性成分度值前5 的关键药效物质与BFHX 干预肺结节最关键的3 个靶点蛋白AKT1、JUN、TP53进行分子对接验证。对接结果如表4所示，结合性最强的化合物-靶点相关的蛋白和化合物三维结构对接图见图6—8。BFHX中的关键活性成分与核心靶点结合能均值为-8.03 kcal/mol，提示这些活性成分与核心靶点蛋白的结合性较强，其中槲皮素与靶点对接活性最好。

图6 核心靶点蛋白AKT1与化合物三维结构对接图

表4 BFHX活性成分-核心靶点分子对接

图7 核心靶点蛋白JUN与化合物三维结构对接图

图8 核心靶点蛋白TP53与化合物三维结构对接图

3 讨论

3.1 肺结节与肺癌间的关系有研究认为，磨玻璃结节样肺癌不同于以往对早期肺癌的认识，是1 种特殊亚型［9］，相关针对49 例患者磨玻璃结节的组织病理学研究显示，肺结节肺腺癌的组织学谱有很强的相关性［10-11］，磨玻璃影的肺恶性结节受持续的激活突变影响，通过免疫逃逸并激活微环境以促进血管生成、侵袭、上皮-间充质改变，最终进展为晚期转移性肿瘤［12］。然而肺结节的术前诊断高度依赖影像学，并且部分实性结节的磨玻璃成分和实性成分在影像学表现与病理学测量上并无特异性［13］，因此对存在判断风险的肺结节进行手术切除，会使患者经受非必要的手术及并发症影响［14］。多组学分析表征显示表现为磨玻璃影的恶性肺结节具有较低的突变负担、较低的活性免疫环境和较少的ctDNA脱落，这可能是其惰性临床病程的机制［15］。低级别亚型结节与早期肺腺癌间的异质性研究可能会揭示这些结节中抗肿瘤免疫和免疫逃逸之间的生物张力，并推动部分肿瘤的后续进展、侵袭和转移［12，16］。

3.2 BFHX 成分分析BFHX 胶囊由黄芪、赤芍、补骨脂组成。方中黄芪具有抗肿瘤、抗衰老、免疫调节、改善化疗药物耐药等作用［17-18］；赤芍对肺动脉高压、心血管系统疾病有良好的治疗效果［19］，可有效抑制癌细胞增殖［20］、诱导肿瘤细胞凋亡［21］、抑制肿瘤细胞迁移和侵袭［22］；补骨脂中的多种化合物具有抗肿瘤、抗癌细胞增殖、抗炎、抗氧化［23-26］的作用。本研究借助数据库获得BFHX 活性成分52个，成分-靶点网络显示的关键化合物包括7-O-甲基异丙胺醇、异补骨脂素、刺芒丙花素、山柰酚、槲皮素等。槲皮素是一种具有抗肿瘤、抗氧化等多种药理作用的黄酮醇类化合物［27］。WANG 等［28］研究表明，槲皮素通过调节miR-16-5p 和WEE1 表达来增强非小细胞肺癌细胞的放射敏感性。在肺腺癌中槲皮素能够抑制PI3K/Akt 信号通路的激活，增强癌细胞对顺铂的耐药性，促进肿瘤细胞的凋亡［29］。异补骨脂素是一种呋喃香豆素类化合物，是中药补骨脂的重要活性成分之一［30］，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等作用［31-32］，可抑制LncRNA THOR 的表达［33］。LncRNA THOR 是一种内源性RNA分子，可以调节肿瘤细胞的生长。在非小细胞肺癌细胞中，Lnc-THOR 通过与IGF2BP1 结合加速非小细胞肺癌细胞的增殖，表明Lnc-THOR 可能是治疗非小细胞肺癌的一种新型靶点［34］。山柰酚是一种黄酮类化合物，具有抗癌、抗炎、抗菌等多种功效［35-36］，它可通过抑制miR21的表达抑制非小细胞肺癌A549 细胞的增殖［37］。miR-21 是一种多效性miRNA，miR-21的过表达可以诱导AKT 的活化从而影响病理性肺重塑［38］，miR-21 的敲除也可抑制细胞增殖、迁移、侵袭和血管生成［39］。刺芒柄花素是中药黄芪中分离出的一种具有生物活性的化合物，具有免疫调节、抗氧化、抗炎、抗癌等作用［40］，刺芒柄花素可以通过抑制NSCLC 中的EGFR-Akt-Mcl-1轴来抑制肿瘤生长［41］，其机制是Bax蛋白受到刺激后激活caspase3表达，抑制AKT表达，诱导Mcl-1 下调，而刺芒柄花素具有良好的体内耐受性［42］，可能是一种潜在的抗肿瘤化合物。

3.3 BFHX 干预肺结节的潜在机制核心靶点在整个网络中具有关键作用，我们依据degree 值筛选出最关键的3个靶点，Jun、AKT1、FOS。Jun原癌基因（c-Jun）、Fos 原癌基因（c-Fos）组成的AP-1转录因子复合物通过上调下游靶基因参与了恶性肿瘤的生长、浸润和转移过程，在肿瘤的进展与逆转中起关键作用［43］，尤其与肺癌的发生密切相关。c-Jun 通过参与细胞有丝分裂在细胞增殖和致癌转化中起到重要功能，也是第一种被发现的纯致癌转录因子，c-Fos 涉及细胞的关键功能，包括分化、增殖、生存及受缺氧和血管生成影响的组织稳态［44-45］。SCHREIBER等［46］发现c-Jun通过负调控其启动因子活性抑制TP53的表达，TP53的负调控可能有助于c-Jun促进致癌转化的能力。刘晓丽等［47］通过发现c-Jun在Ⅲ～Ⅳ期肺癌组织中阳性表达明显强于Ⅰ～Ⅱ期，表明c-Jun与肺癌组织的恶性程度密切相关。AKT1是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine-specific protein kinase，AKT）的主要亚型，主要参与细胞分化、增殖和凋亡进程，在包括肺癌在内的多种癌症中表现出过度活化。研究显示磨玻璃结节的AKT 酶显著高于正常对照组织，考虑其可能通过诱导细胞周期蛋白D1表达增加共同起到诱导细胞增殖的作用［48-50］，亦有研究显示，在Ⅰ型胰岛素样生长因子受体（insulinlike growth factor Ⅰ receptor，IGF-IR）诱导肺肿瘤模型的小鼠体内AKT 水平明显升高且肺肿瘤表现为单个或多个散在结节［51］，猜测BFHX可能通过抑制AKT1干预肺结节。

3.4 BFHX 干预肺结节的潜在通路通过KEGG 富集分析，我们发现脂质与动脉粥样硬化信号通路与肺结节的发生密切相关。一项针对良恶性肺结节患者的血浆代谢组学分析显示，与良性肺结节患者相比，恶性肺结节患者血浆中的氨基酸代谢、脂质代谢和胆固醇代谢受到严重干扰。与健康组相比，良恶性肺结节患者的血浆代谢物检测到共同的代谢特征，这提示良恶性肺结节有相同的变化趋势［52］。脂质代谢异常会导致局部脂质堆积，对细胞膜的生物物理性质产生影响［53］，而磷脂参与维持细胞结构和细胞器完整，良恶性肺结节患者血浆磷脂水平下降可能提示磷脂保护作用下降，细胞生物膜和脂质双分子层遭到破坏。这也与GO 分析发现BFHX 干预肺结节的主要靶点集中在细胞膜、跨膜转运蛋白复合物上的结论不谋而合。

本研究基于网络药理学和分子对技术探讨补肺活血胶囊干预肺结节的潜在机制，将中医整体、辨证思维模式与现代药理研究方法结合起来，构建了体现中医药特点的研究方法。阐明了补肺活血胶囊干预肺结节的可能活性成分及靶标蛋白质的生物功能，通过模拟关键药效物质-靶标蛋白的相互作用揭露了补肺活血胶囊的作用机制。结果表明鞣花酸、芍药苷、黄芩素、β-谷甾醇等物质可能通过调控Jun、AKT1、FOS 等靶点蛋白，对脂质与动脉粥样硬化、流体剪切应力与动脉粥样硬化、IL-17、TNF 等信号通路进行干预，发挥抗肿瘤、抗癌细胞增殖、抗炎、抗氧化等作用，为深入研究补肺活血胶囊干预肺结节的活性成分及机制提供了坚实的科学理论基础。