麻杏石甘汤调控TLR4/NF-κB 信号通路治疗慢性阻塞性肺疾病的机制

李莉莎，王凤婵

青岛市中医院,山东 青岛 266033

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种常见的呼吸系统疾病，临床表现主要是由肺部慢性炎症所引发的呼吸道气流受限、慢性支气管炎、肺气肿等，若不及时加以控制，会引发更严重的肺心病及呼吸困难，严重威胁患者生命［1-2］。目前，现代医学用于治疗COPD 的药物主要是糖皮质激素、抗生素等，可以缓解急性期症状，但难以稳定控制肺部炎症［3-4］。近些年来，多项研究发现，麻杏石甘汤治疗COPD 有很好的疗效，能有效控制肺部炎症反应，维持肺组织完整，改善呼吸困难，从而有效治愈COPD，然而其治疗COPD 的机制仍不明确［5-6］。既往研究已经明确，Toll 样受体4（toll-like receptor 4 polypeptide，TLR4）/与炎症反应密切相关，TLR4与某些大分子物质结合后，能够激活炎症反应关键介质核因子κB（nuclear factorkappa B，NF-κB），进而调控促炎因子表达，因而TLR4/NF-κB 信号通路是调节机体炎症反应的重要信号通路。研究证实，调控TLR4/NF-κB 信号通路可改善COPD 后的炎症［7-9］。MMP-9 是细胞外基质的重要组成部分，能够促进细胞外基质的分解，研究发现异常的MMP-9 表达与肺功能的损害有着密切联系［10-11］。因此，本次研究着重探讨麻杏石甘汤对TLR4/NF-κB信号通路、MMP-9的调节作用及对炎症因子白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）和白细胞介素18（interleukin-18，IL-18）表达的影响，明确麻杏石甘汤治疗COPD的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF 级实验用6～8 周龄SD 大鼠36 只，购于上海斯莱克实验动物公司，实验动物许可证：SCXK（沪）2014-0003。实验大鼠饲养于青岛市实验动物中心，给予充足的无菌饲料及无菌水正常饲养，保持室温以及每日12 h 的光照时间，适应性喂养1周后开始造模。

1.2 试剂及仪器麻杏石甘汤药物组成：麻黄9 g，杏仁9 g，甘草6 g，石膏18 g。所有中药均购于青岛市中医院中药房，加工成每毫升中药制剂中含药1 g的汤剂药。LPS（Sigma，美国，批号：L-8274）；一抗：anti-TLR4（Abcam，美国，批号：ab2204）、anti-NF-κB p65（CST，美国，批号：#8242）、anti-MMP-9抗体（Abcam，美国，批号：ab76003）；二抗（Abcam，美国，批号：ab6721，ab6728）；ELISA 试剂盒（索莱宝，北京，批号：SEKR-0005、SEKR-0054）；PVDF 膜（Immobilon，美国，批号：IPFL00010）。HI-801 型肺功能检测仪（Chest，日本）；DM500 型光学显微镜（莱卡，德国）。

1.3 实验方法

1.3.1 造模及分组 采用随机数表法将36 只实验用SD 大鼠随机分为正常组、模型组、治疗组，每组12 只。适应性喂养1 周后，正常组仅行气管切开并缝合后不予任何处理，模型组和治疗组采用吸烟联合LPS 滴入气管的方式复制大鼠COPD 模型［12］，具体方法为：干预第1、14天，用1%的戊巴比妥钠溶液按5 mL/kg 的量注入大鼠腹腔使其麻醉后，借助喉镜将200 μL 的LPS（浓度为1 mg/mL）于1 s 内注入大鼠气道内，并使大鼠直立，旋转大鼠使LPS 均匀流入两侧肺中；第2～13、15～28 天于密闭容器内给予大鼠香烟吸入，每日2 次，间隔8 h，每次吸烟时间为30 min。造模成功表现：大鼠出现频繁呛咳，提示造模成功。

1.3.2 给药方法 治疗组自第14 天开始每日早晚给予麻杏石甘汤灌胃（按大鼠和人的体表面积法计算结果为6.3 g/kg，大鼠每日灌胃2次，故每天灌胃量为12.6 g/kg），假手术组和模型组不予药物干预。连续灌胃4周后取材。

1.3.3 标本采集 大鼠麻醉成功后，每组6 只大鼠直接取材，即打开胸腔后直接取出大鼠部分肺组织，并用生理盐水迅速冲洗后置于EP 管中，于-80 ℃下保存以备用，用于后续Western blot 实验，取出另一部分新鲜肺组织捣碎，离心半径10 cm，13 000 r/min 离心20 min，吸取上清液于-80 ℃下保存备用，用于ELISA 检测；剩余每组6 只大鼠采用多聚甲醛灌注固定后取材，大鼠麻醉成功后剪开大鼠胸腔，暴露心脏，自左心耳处切一小口，灌注200 mL生理盐水冲洗血管组织后继续灌注4%多聚甲醛200 mL以固定组织，然后取出肺组织，浸泡于4%多聚甲醛溶液中进行固定，用于HE 染色。

1.4 观察指标

1.4.1 肺功能检测 采用小动物肺功能仪进行检测，方法为：取材前4 h 对所有大鼠进行肺功能检测，将1%的戊巴比妥钠溶液（注射量为5 mL/kg）腹腔注射至大鼠体内麻醉大鼠，待大鼠麻醉成功后，将大鼠仰卧固定于固定台上，消毒脖颈后，作一长约2 cm 手术切口，缓慢暴露气管后将气管T型切开，然后连接小动物肺功能检测仪进行吸气阻力（inspiratory resistance，Ri）、呼气阻力（respiratory resistance，Re）和肺组织顺应性（dynamic lung compliance，Cdyn）的检测。

1.4.2 HE 染色观察肺组织病理改变 将固定好的组织经过脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片、展片、烤片后制作成5 μm 厚的肺组织切片，将上述肺组织切片脱蜡后采用HE 染色试剂盒进行染色，最后于二甲苯中透明处理后即可采用中性树胶封片，光镜下观察，采集图片。

1.4.3 Western blot检测MMP-9、TLR4、NF-κB p65蛋白相对表达量 采用BCA 法测好总蛋白浓度后进行上样处理，依次进行凝胶电泳，转至PVDF 膜上，用脱脂奶粉于4 ℃下封闭1.5 h后加入配置好的MMP-9和TLR4、NF-κB p65单克隆抗体（1∶1000）在4 ℃下充分孵育反应过夜，PBST 漂洗，加入二抗（1∶1000）于常温下作用1.5 h后进行显色处理，采用凝胶成像系统显示条带。

1.4.4 ELISA检测炎症因子IL-6和IL-18水平 解冻肺组织离心后的上清液，并按照1∶100 比例用PBS 缓冲液稀释，使用Elisa 试剂盒按照样本说明书检测炎症因子IL-6和IL-18水平。

1.5 统计学方法使用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以±s表示，采用t检验，等级资料采用秩和检验，P＜0.05提示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肺功能模型组和治疗组Ri、Re 显著高于正常组（P＜0.05），Cdyn 显著低于正常组（P＜0.05）；治疗组Ri、Re显著低于模型组（P＜0.05），Cdyn显著高于模型组（P＜0.05）。见图1。

图1 各组大鼠肺功能水平

2.2 大鼠肺组织病理改变正常组肺小叶结构完整，肺泡壁结构正常，无增厚、塌陷，间质中无炎性颗粒浸润；模型组肺泡结构严重塌陷、肺泡壁连续性消失，出现增厚，肺间质大量炎性因子浸润，出现充血、水肿；治疗组可见完整肺泡结构，肺间质中稍见充血现象。见图2。

2.3 Western blot检测各蛋白表达结果Western blot 显示，模型组和治疗组的MMP-9、TLR4、NF-κB p65 蛋白相对表达量显著高于正常组，差异具有统计学意义（P＜0.05），治疗组MMP-9、TLR4、NF-κB p65 蛋白相对表达量低于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图3、表1。

图3 各组大鼠MMP-9、TLR4、NF-κB p65蛋白相对表达量电泳图

2.4 ELlSA 检测炎症因子水平ELISA 结果显示模型组和治疗组IL-6和IL-18的表达量显著高于正常组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；治疗组IL-6 和IL-18 含量显著低于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠蛋白相对表达量及炎症因子水平比较（±s）

表1 各组大鼠蛋白相对表达量及炎症因子水平比较（±s）

注：正常组相对于自身比值为1；*表示与正常组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05

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3 讨论

近些年来COPD 的发病率逐年升高，成为关注的公共卫生问题。目前医学界广泛认为，长期的吸烟及吸入有害颗粒或有毒气体等导致气道发生炎症是COPD发生的原因［13-14］。因此本研究亦采取公认的LPS 气道吸入加吸烟的造模方法来制备大鼠COPD 模型，且本次实验ELISA 结果显示模型组炎症因子IL-6 和IL-18 表达升高，HE 染色结果也提示模型组肺泡结构严重塌陷，肺泡壁连续性消失，肺泡壁增厚，肺间质充血、水肿等，这与文献报道COPD的表现一致，说明本次实验COPD模型的建立是成功的。

外界因素不断刺激，致使气道持续性出现炎症因子，这些炎症因子不断堆积并侵袭到肺组织内，使整个肺组织遭到炎症因子的攻击，导致肺组织出现损伤，正常结构遭到破坏，生理功能亦受到严重影响，引起气体交换困难，肺组织的顺应性减低等［15-16］。本实验中模型组大鼠炎症因子表达较其余两组高，大鼠呼吸也较其余两组更困难，肺组织顺应性也低于其余两组，亦说明炎症是导致COPD的重要原因。因此，从炎症因子的角度出发，去探究COPD 发病的具体病理机制，继而去研究相应的治疗手段，具有重大意义。

大量研究证实，TLR4/NF-κB信号通路与炎症的发生发展有着密切联系，TLR4 被激活后所引起的一系列级联反应，继而激活其下游的NF-κB p65，活化后的NF-κB p65 转移到细胞核内结合促炎基因的启动子，使得炎症因子不断激活并释放到组织中造成炎症损伤［17-19］。因此，防止TLR4/NF-κB信号通路的活化是治疗炎症的重要靶点，且针对COPD的研究［20-21］也发现，COPD 患者TLR4 表达较高，而NF-κB 与气道炎症的产生联系密切，这提示TLR4/NF-κB信号通路与COPD的产生密不可分。本研究亦发现，COPD 大鼠TLR4、NF-κB 表达较正常组高。细胞外基质是维持内环境稳态的重要物质，MMP-9是一种能促进其分解的酶类，正常组织中表达较少，当受到刺激出现MMP-9 大量异常活化后，细胞外基质发生过度分解，内环境稳态遭到破坏，继而出现纤维细胞增多，血管过度扩张，肺泡壁间隔增厚，肺实质损伤，肺功能下降等一系列病理表现。大量研究表明，MMP-9 的表达可接收TLR4/NF-κB的调控作用，进一步研究发现，通过抑制TLR4/NF-κB信号通路可减少MMP-9的活化，继而减少肺泡壁及其间隔出现增厚现象，从而缩小炎症因子浸润的场所。本实验中，模型组TLR4、NF-κB、MMP-9表达均高于正常组，进一步证实，TLR4/NF-κB信号通路可调控MMP-9的表达。

中医学将COPD 归纳为“肺胀”范畴，机体肺脏遭到外邪侵袭，肺失宣降，气机壅阻不畅，津液无法正常舒布，故聚而为痰，痰邪反过来亦能阻遏肺气。如此反复循环继而加重呼吸困难，再者痰阻气滞，血液失去推动，机体可进一步出现水饮、瘀血。且痰邪从寒而伤阳，从热而损阴，机体正气受损，无力御邪，进而易感受外邪袭扰，如此反复为病。因此痰邪既是病理产物，亦是致病因素，贯穿COPD 的发病始末，而由于气候变暖、大气环境污染、饮食结构改变导致湿热内生等因素，痰邪多夹杂热邪，痰热壅肺证是COPD的主要证型［22］。

麻杏石甘汤出自《伤寒论》。方中以麻黄为君药，取其解表散寒、宣肺平喘之功，取“火郁发之”之意，石膏为臣药以解肌透热生津，佐以杏仁降肺气，再以甘草调和诸药。全方共奏清痰热，降肺气，平喘止咳之功效。因此从中医学理论角度出发，麻杏石甘汤治疗COPD 是可行的。此外基础和临床研究也发现，麻杏石甘汤可减少COPD 后的炎症堆积，改善呼吸，促进肺损伤的修复。

本研究通过肺功能检测Ri、Re、Cdyn 发现，麻杏石甘汤可改善呼吸困难，提高肺组织顺应性。HE 染色提示麻杏石甘汤可减少肺泡壁增厚，抑制肺组织纤维化。Western blot 结果提示麻杏石甘汤可抑制COPD大鼠TLR4/NF-κB信号通路活化，抑制MMP-9 的表达。ELISA 结果证实麻杏石甘汤可减少COPD 大鼠IL-6 和IL-18 炎症因子的表达。综上所述，麻杏石甘汤可通过抑制TLR4/NF-κB 信号通路活化，减少MMP-9 表达的同时，还可抑制炎症因子IL-6和IL-18的分泌，从而治疗COPD。