蒲公英、金银花水提剂及颗粒剂对4种致病菌的抑菌作用

谷晓雨，李会，张佩，刘轩嘉，李博文，刘超怡

蒲公英为菊科植物，又名婆婆丁、黄花地丁及黄花三七等，其化学成分主要有黄酮类、植物甾醇类、香豆素类、倍半萜类及挥发油类等[1]。蒲公英苦甘寒，归肝胃二经，具有清热解毒、散结及利尿活血等功效[2]。多篇研究报道蒲公英对细菌、真菌及病毒有不同程度的抑菌作用[3-5]。金银花自古被誉为清热解毒的良药，其性味甘寒而不伤胃，芳香透达又可祛邪，既可宣风散热，还可清热解毒，用于治疗身热、发疹、发斑及咽喉肿痛等各种热性病[6]。多篇报道显示金银花具有广谱抗菌作用。蒲公英和金银花为广泛使用的中药，其水提剂与颗粒剂的抑菌效果差异尚不明确。本实验旨在比较蒲公英、金银花水提剂与颗粒剂的抑菌效果，观察两者联用的抑菌效果，为药物使用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)实验药品：蒲公英全草、蒲公英根、金银花均购自河南省张仲景大药房股份有限公司。蒲公英颗粒剂由江西和明药业有限公司生产，国药准字Z36021952，规格：每袋装10 g，相当于6.5 g饮片；金银花由江西和明药业有限公司生产，国药准字Z20063606，规格：每袋装10 g，相当于3.5 g饮片。(2)实验菌株：标准菌株大肠杆菌 ATCC25922、白色念珠菌ATCC10231、蜡样芽孢杆菌ATCC14579均购于中国医学菌种保藏管理中心；金黄色葡萄球菌ATCC29213购于中国药品生物制品检定所。(3)实验试剂：M-H(A) 琼脂、M-H(B)肉汤购自北京奥博星生物技术有限责任公司；0.9%NaCl注射液购自山东齐都药业有限公司。(4)实验仪器及耗材：SW-CJ-1FD超净台，购自上海锦昱科学仪器有限公司；SC-329CA海尔冰箱；BGZ-246干燥箱、BXM-30R立式高压灭菌器，购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DRAGON移液枪；DHP-9162数显电热恒温培养箱，购自上海浦东荣丰科学仪器有限公司；GH-500BC隔水保温箱，购自北京市永光明医疗仪器有限公司；FA2004N分析天平，购自上海箐海仪器有限公司；H·SWX-600BS恒温水浴箱，购自上海圣科仪器设备有限公司；YRE-2010Z旋转蒸发仪，购自巩义市予华仪器设备有限公司；TYZD-1微量振荡器，购自上海左乐仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 药液制备：(1)不同浓度中药水提剂的制备：称取蒲公英根、蒲公英全草、金银花各75 g、100 g、150 g，分别置于砂锅中加入适量蒸馏水浸泡30 min，大火煮沸后改用文火煎煮1 h，趁热用无菌纱布将其过滤至烧瓶中，旋转蒸发仪蒸发浓缩后放凉至室温，用50 ml容量瓶定容后，分别得到浓度为150%、200%、300%的中药煎剂溶液，将其放置于无菌小玻璃瓶中，高压灭菌后，即得1.5 g/ml、2 g/ml、3 g/ml的蒲公英根、蒲公英全草、金银花的水提剂，冷却后4 ℃避光保存备用。(2)不同浓度中药颗粒剂的制备：按照商品化蒲公英、金银花颗粒剂中药物含量说明，分别称取相当于原中药饮片75 g、100 g、150 g的蒲公英、金银花颗粒剂，将其分别放置于烧杯中加入蒸馏水溶解，用50 ml容量瓶定容后放置于无菌小输液瓶中，分别得到浓度为150%、200%、300%的中药颗粒水溶液，高压灭菌后，即得1.5 g/ml、2 g/ml、3 g/ml的蒲公英颗粒剂、金银花颗粒剂的水溶液，冷却后4 ℃避光保存备用。

1.2.2 菌液制备：冷冻保存的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及蜡样芽孢杆菌无菌操作，划线接种于M-H(A)平板上，37 ℃恒温培养箱内培养18 h。取单菌落接种至 M-H(B)肉汤，37 ℃ 震荡培养24 h，校正菌液浓度至0.5麦氏，用生理盐水稀释成1.5×105CFU/ml的菌悬液备用。

1.2.3 药物敏感试验：采用琼脂打孔法对上述药物进行药敏试验。(1)接种：用移液枪分别取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及白色念珠菌的稀释菌悬液100 μl置于无菌培养皿内，再向培养皿中加入冷却至55 ℃的 M-H(A)培养基25 ml，混合均匀冷却后即得相应的带菌平板。用无菌棉签蘸取蜡样芽孢杆菌菌悬液均匀涂布M-H (A)培养基上。(2)加药：用打孔器在平板均等位置上打4个孔，3个孔用于加入不同稀释度的药物100 μl，第4孔加入生理盐水100 μl做阴性对照。(3)孵育观察：所有平板置于37 ℃培养箱中孵育16～18 h，游标卡尺量取抑菌圈直径。每个实验重复3次取平均值。抑菌结果观察指标：抑菌圈直径>20 mm为高度敏感，11～20 mm为中度敏感，7～10 mm为低度敏感[7]。

1.2.4 最低抑菌浓度(MIC)测定：采用微量稀释法检测蒲公英全草、金银花颗粒剂和水提剂的MIC。在96孔板横向1-11小孔内各加入M-H(B)肉汤100 μl，纵向1号孔内分别加入1.5 g/ml的蒲公英全草颗粒剂100 μl、蒲公英全草水提剂100 μl、金银花颗粒剂100 μl、金银花水提剂100 μl；分别将药物对倍稀释至9号孔，则1-9号孔的药液浓度分别为750 mg/ml、375 mg/ml、187.50 mg/ml、93.75 mg/ml、46.88 mg/ml、23.44 mg/ml、11.72 mg/ml、5.86 mg/ml、2.93 mg/ml；用移液枪取1.5×105CFU/ml的菌悬液100 μl分别加入1-10号孔内，则10号孔为无药物只有菌液的阳性对照，11号孔为只有空白肉汤的阴性对照，12号孔为只加药液100 μl的阴性对照。每种药物做3个重复，接种完成后，微量振荡器上振荡1 min使其混匀，置37 ℃培养16～20 h。孔内清晰不出现细菌生长的最低药物浓度即为该抗菌药物对该检测菌的MIC。

1.2.5 联合抑菌试验：采用微量棋盘法测定联合抑菌效果，在无菌96孔板中加入A药、B药，横向孔分别加入50 μl 1/8 MIC到8 MIC的A药，纵向孔分别加入50 μl 1/8 MIC到8 MIC的B药，各个孔加入0.5麦氏的待测菌液100 μl，于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，孔内清晰不出现细菌生长的最低药物浓度即为联合抗菌药物对该检测菌的MIC。联合抑菌结果判断依据：分级抑菌浓度(FIC)指数=(A药联合的MIC/A药单侧MIC)+(B药联合的MIC/B药单侧MIC)，FIC指数≤0.5为协同作用，>0.5～1(包括=1)为相加作用，>1～2为无关作用，>2为拮抗作用。

2 结 果

2.1 蒲公英、金银花水提剂及颗粒剂对4种致病菌的抑菌作用 蒲公英全草对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌及蜡样芽孢杆菌均有一定的抑菌作用，且随着药物浓度的增加，抑菌效果增强；其中金黄色葡萄球菌对所有浓度的蒲公英水提剂及颗粒剂均为中度敏感(抑菌圈直径11～20 mm)，大肠杆菌、白色念珠菌、蜡样芽孢杆菌对蒲公英水提剂及颗粒剂均为低度敏感(抑菌圈直径7～10 mm)。金银花对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有一定的抑菌作用，且随着药物浓度增加，抑菌效果也逐渐增强，其中金黄色葡萄球菌对所有浓度的金银花水提剂及颗粒剂均为中度敏感(抑菌圈直径11～20 mm)，大肠杆菌对所有浓度的金银花水提剂及颗粒剂均低度敏感(抑菌圈直径7～10 mm)；金银花对白色念珠球菌、大肠杆菌无抑菌作用。比较两种剂型的抑菌结果显示，蒲公英全草颗粒剂和金银花颗粒剂的抑菌作用均优于水提剂(P<0.05)，见表1。

表1 中药颗粒剂和水提剂对四种致病菌的抑菌作用

2.2 蒲公英、金银花水提剂及颗粒剂对4种常见致病菌的MIC值 蒲公英颗粒剂对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌的MIC为46.88 mg/ml，对大肠杆菌、白色念珠菌的MIC为23.44 mg/ml；蒲公英全草水提剂对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌的MIC为93.75 mg/ml，对大肠杆菌、白色念珠菌的MIC为46.88 mg/ml。金银花颗粒剂对金黄色葡萄球菌的MIC为46.88 mg/ml，对大肠杆菌的MIC为93.75 mg/ml；金银花水提剂对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的MIC为93.75 mg/ml，金银花对白色念珠菌和蜡样芽孢杆菌无抑菌作用，见表2。

表2 蒲公英、金银花水提剂及颗粒剂对4种常见致病菌的MIC值

2.3 蒲公英、金银花水提剂及颗粒剂联合应用的作用效果 蒲公英颗粒剂和金银花颗粒剂联用对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌呈现相加作用，见表3。蒲公英水提剂和金银花水提剂联用对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的抑菌呈现相加作用，见表4。

表3 蒲公英、金银花颗粒剂联用对2种致病菌的抑菌作用

表4 蒲公英、金银花水提剂联用对2种致病菌的抑菌作用

3 讨 论

抗生素在临床治疗中应用广泛，但其导致的不良反应、耐药性等问题日益凸显。在疾病治疗过程中耐药菌的产生与日俱增，增加了疾病治疗的难度。中药在临床使用过程中以其安全有效、较少出现耐药等优点受到广泛的关注。

蒲公英、金银花含有多种药用活性成分，具有不同程度的抑菌作用。本实验表明，蒲公英的抑菌作用效果优于金银花，两者联用抑菌效果增强；比较两种中药的颗粒剂与水提剂对常见致病菌抑菌效果，结果显示，颗粒剂抑菌效果较好，与李健[8]的结果存在一定的差异，可能是因为中药水提剂制作繁杂且无统一煎煮标准，可能产生质量差异，市面上的中药饮片出厂家不同、制作方法不同导致作用效果的差异[9]；在实验过程中不排除误差的影响，本实验采取的是打孔法测定抑菌作用，药物可能通过小孔外渗进而影响实验结果。

本实验为体外抑菌实验,虽可证明蒲公英、金银花两种中药具有抑菌作用,但其临床应用效果还需进一步进行验证。只有进一步的进行探讨和比较，才能为临床用药提供有力的依据。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突。