PCR-RFLP在VVC相关念珠菌菌种鉴定中的应用

丁文静，渠巍，文田甜

(贵阳市妇幼保健院检验科，贵阳 550003)

外阴阴道念珠菌病(vulvovaginal candidosis, VVC)是妇科常见的感染性疾病，反复感染极易发展成为复发性外阴阴道念珠菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis, RVVC)，是临床研究和治疗的重点和难点[1]。VVC及RVVC的主要致病菌为白念珠菌，但是随着免疫缺陷人群的增多，免疫抑制剂在临床上的使用频率增加，常规抗真菌药物的广泛使用等因素使非白念珠菌引起的念珠菌病越来越多，白念珠菌分离率呈明显下降趋势。然而，不同念珠菌对抗真菌药物的敏感性存在差异，研究发现，非白念珠菌对同种药物的敏感性明显低于白念珠菌，光滑念珠菌对两性霉素B和三唑类抗真菌药物的耐药性较高，克柔念珠菌对氟康唑天然耐药[2-3]。所以，早期、准确鉴定念珠菌菌种(特别是非白念珠菌)将有利于指导临床治疗。

近年来，分子生物学的飞速发展为微生物的鉴定工作提供了新的途径，其中，限制性内切酶片断长度多态性PCR(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)因其操作简便，灵敏度和特异性较高等特点，广泛应用于多种微生物的鉴定。本研究期望应用PCR-RFLP分析法对多个念珠菌菌种进行鉴定，并且以念珠菌ITS区段测序结果为“金标准”，对科玛嘉显色培养法、Vitek 2 YST鉴定卡、PCR-RFLP 3种方法对念珠菌菌种的鉴定效果进行比较分析，进而选择一种简单、快速、准确的鉴定方法。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集贵阳市妇幼保健院2015年6月—2016年5月VVC相关念珠菌培养阳性菌株100株。白念珠菌ATCC 90028、近平滑念珠菌ATCC 22019、克柔念珠菌ATCC 6258由贵州医科大学南校区临床医学研究中心馈赠，热带念珠菌ATCC 13803、光滑念珠菌ATCC 15126购于北京中科质检有限公司。临床菌株和标准菌株均用石蜡油保存法保存菌种。

1.2主要试剂与仪器 PCR mix、引物(ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′、ITS4:5′-TCCTCCGC

TTATTGATATGC-3′)、MspⅠ酶、ApaⅠ酶、NcoⅠ酶(贵州宏达尔生物科技有限公司)，沙保罗琼脂平板(郑州安图生物工程公司)，科玛嘉显色培养基(法国Chromagar公司)，Vitek 2 YST鉴定卡(法国生物梅里埃公司);Vitek 2 Compact仪(法国生物梅里埃公司),9700 PCR扩增仪(美国ABI公司),电泳仪和凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1PCR扩增 十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)法提取DNA，使用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增。PCR反应体系为13 μL PCR mix，10 μL ddH2O，1 μL ITS1引物，1 μL ITS4引物，1 μL DNA样品。扩增条件:94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃60 s，35个循环；72℃ 10 min。扩增产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果提交NCBI的Blast软件进行比对分析(Nucleotide BLAST)，确定念珠菌菌种。

1.3.2PCR-RFLP技术鉴定念珠菌 PCR方法同1.3.1。用限制性核酸内切酶MspⅠ、ApaⅠ与NcoⅠ对筛选出的100株念珠菌及5株标准菌株的PCR扩增产物进行酶切分析。将PCR扩增产物用限制性核酸内切酶MspⅠ进行酶切，37 ℃反应2 h，同时，对疑似近平滑念珠菌的菌株分别采用ApaⅠ与NcoⅠ进行二次酶切，37 ℃反应2 h。酶切产物于20 g/L琼脂凝胶电泳后在凝胶成像系统中显像，比较酶切后的电泳条带，确定念珠菌菌种。不同念珠菌种的ITS核苷酸序列不同，限制性核酸内切酶能够识别并附着特定的核苷酸序列，并对特定部位的核苷酸进行酶切，不同菌种就会产生不同大小的酶切片段。

1.3.3科玛嘉显色培养基鉴定念珠菌 采用沙保罗琼脂培养基对105株念珠菌进行复苏，传代培养后挑选单个菌落接种于科玛嘉显色培养基，25 ℃培养48 h后观察结果。显色结果判读标准：生长呈绿色菌落为白念珠菌，蓝灰色或铁蓝色菌落为热带念珠菌，粉红色(绒毛状)菌落为克柔念珠菌，淡紫色菌落为光滑念珠菌，白色为其他念珠菌。

1.3.4Vitek 2 YST鉴定卡鉴定念珠菌 将105株念珠菌复苏至沙保罗琼脂平板，传代培养后，按照Vitek 2 Compact仪(version 7.01)的标准操作规程,挑取纯菌落进行生化鉴定，并记录鉴定结果。

2 结果

2.1105株念珠菌的测序结果 5株标准菌株测序结果分别为白念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌各1株。100株临床菌株测序结果为白念珠菌41株，光滑念珠菌18株，克柔念珠菌8株，热带念珠菌10株，近平滑念珠菌5株，挪威念珠菌3株，葡萄牙念珠菌6株，酿酒念珠菌2株，Cyberlindnerafabianii5株，Candidaorthopsilosis1株，Candidametapsilosis1株。

2.2PCR-RFLP法鉴定结果

2.2.1MspⅠ酶切结果 PCR-RFLP法中被MspⅠ酶切割为271 bp、240 bp左右的2条条带的白念珠菌42株(包含标准菌株1株)，被切割为533 bp、317 bp左右的2条条带的光滑念珠菌19株(包含标准菌株1株)，被切割为316 bp、187 bp左右的2条条带的热带念珠菌11株(包含标准菌株1株)，被切割为250 bp、232 bp左右的2条条带的克柔念珠菌9株(包含标准菌株1株)，被切割为527 bp、148 bp左右的2条条带的酿酒念珠菌2株，被切割为230 bp、119 bp左右的2条条带的葡萄牙念珠菌6株，被切割为227 bp、231 bp左右的2条条带的挪威念珠菌3株，没有酶切位点、电泳产生596 bp左右的1条条带的Cyberlindnerafabianii5株，电泳产生500 bp左右的1条条带的菌株8株(包含近平滑念珠菌标准菌株1株)。见图1、图2。

注：1、2，热带念珠菌2株；3、4，挪威念珠菌2株；5，光滑念珠菌1株；6，近平滑念珠菌1株；7，Candidametapsilosis1株；8，DNA marker；9、10，白念珠菌2株；11、12、13，克柔念珠菌3株；14，酿酒念珠菌1株；15，Cyberlindnerafabianii1株；16，空白对照；17，白念珠菌1株；18、19，葡萄牙念珠菌2株；20，Candidaorthopsilosis1株。

图118株念珠菌PCR产物电泳分析

注：1—18，分别为热带念珠菌2株、挪威毕赤念珠菌2株、光滑念珠菌1株、近平滑念珠菌1株、Candidametapsilosis1株、白念珠菌2株、克柔念珠菌3株、酿酒念珠菌1株、Cyberlindnerafabianii1株、白念珠菌1株、葡萄牙念珠菌2株、Candidaorthopsilosis1株；M，DNA marker。

图218株念珠菌MspⅠ酶切结果

2.2.2疑似近平滑念珠菌的ApaⅠ、NcoⅠ酶切结果 经MspⅠ酶切后产生500 bp左右的菌株进行二次酶切，被ApaⅠ酶、NcoⅠ酶均切割为408、78 bp左右的2条条带的Candidaorthopsilosis1株，仅被ApaⅠ酶切割为414、89 bp左右的2条条带的Candidametapsilosis1株；均不被ApaⅠ酶、NcoⅠ酶切的近平滑念珠菌6株(包含标准菌株1株)。见图3。

2.3显色培养基、Vitek 2 YST鉴定卡结果及3种方法比较分析

注：1～6，分别为CandidaOrthopsilosis1株、近平滑念珠菌1株、Candidametapsilosis1株、CandidaOrthopsilosis1株、近平滑念珠菌1株、Candidametapsilosis1株；M，DNA marker。

图3疑似近平滑念珠菌的ApaⅠ、NcoⅠ酶切结果

2.3.1法国科玛嘉显色培养基(CHROMagar)鉴定结果 105株念珠菌中，白念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌在法国科玛嘉显色培养基上均显色正确。鉴定错误的7株菌落显紫色的菌株，经PCR扩增结果为5株葡萄牙念珠菌，2株酿酒念珠菌。见表1。

表1 法国科玛嘉显色培养基(CHROMagar)鉴定结果

2.3.2Vitek 2 YST鉴定卡鉴定结果 105株菌株中，1株白念珠菌与2株热带念珠菌Vitek 2 YST鉴定卡鉴定不出，Cyberlindnerafabianii、Candidaorthopsilosis与Candidametapsilosis鉴定错误，其余菌株均鉴定正确。鉴定错误菌株均进行2次重复试验，结果一致。见表2。

表2 Vitek 2 YST鉴定卡鉴定结果

2.3.33种方法比较及方法学评价 科玛嘉显色培养法对白念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌等3种念珠菌鉴定正确率100%，对光滑念珠菌的鉴定正确率为73.1%；Vitek 2 YST鉴定卡可鉴定常见念珠菌且正确率较高，不能鉴定Cyberlindnerafabianii、Candidaorthopsilosis与Candidametapsilosis等非常见念珠菌；PCR-RFLP技术可准确鉴定所有念珠菌菌种。见表3。

表3 3种方法鉴定105株念珠菌的比较分析

3 讨论

临床实验室主要是通过直接镜检、显色培养基、生化鉴定等方法来鉴定念珠菌菌种，其中，显色培养基具有操作简便、快速的优点，且试剂材料价格适中，便于临床使用。研究发现，光滑念珠菌、白念珠菌在科玛嘉显色培养基上也会显白色，汉逊念珠菌和酿酒念珠菌在显色培养基上绝大部分呈紫色[4]。显色培养基对光滑念珠菌的鉴定效果也存在一定的争议。本研究使用科玛嘉显色培养法能准确鉴定白念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌等3种念珠菌，对光滑念珠菌的鉴定敏感性高，但特异性较低。但由于本次研究的菌株数较少，需进一步增加实验数据进行验证。

Vitek 2 YST鉴定卡可鉴定大部分念珠菌菌种，但操作较为繁琐且耗时长，对不同培养基上同一菌种的鉴定准确率也存在差异[5]。同时，菌种数据库中没有的少见念珠菌也不能得到准确的鉴定，且鉴定的前提是保证念珠菌的纯度，当遇到形态相似的混合念珠菌感染时，也可能被错当成1种念珠菌进行鉴定而导致结果错误。本次实验中，Vitek 2 YST鉴定卡可准确鉴定4种常见念珠菌中的大部分菌株，而1株白念珠菌与2株热带念珠菌鉴定不出，其他念珠菌中，Cyberlindnerafabianii被错误的鉴定为产脘念珠菌(产脘念珠菌为Vitek鉴定结果，Cyberlindnerafabianii为基因测序结果)，Candidaorthopsilosis与Candidametapsilosis鉴定为近平滑念珠菌，其他念珠菌均鉴定正确，因此，此方法可用作科玛嘉显色培养法的补充。但不能准确鉴定Cyberlindnerafabianii、Candidaorthopsilosis和Candidametapsilosis等非常见念珠菌，可能是由于这3种念珠菌比较少见，细菌鉴定库不完善导致。

随着分子生物学技术的不断发展，各种分子生物学技术逐步应用于微生物的鉴定[6]。PCR-RFLP具有灵敏度和特异性高、操作简便等特点，广泛应用于多种微生物的鉴定。Pakshir等[7]实验证明念珠菌ITS基因是念珠菌鉴定较传统方法更准确可靠的材料。Leena等[8]已成功应用PCR-RFLP方法鉴定临床常见致病性念珠菌。本次实验中，使用限制性核酸内切酶MspⅠ进行酶切，可将大部分念珠菌扩增产物切开，电泳后产生不同大小的特异性条带，可据此进行念珠菌的鉴定，其中近平滑念珠菌、Candidaorthopsilosis与Candidametapsilosis没有MspⅠ的酶切位点，且其基因序列长度相近，无法应用MspⅠ酶切的方法进行鉴定，而应用NcoⅠ酶可将Candidaorthopsilosis与近平滑念珠菌、Candidametapsilosis2种菌鉴别开，ApaⅠ酶可进一步将近平滑念珠菌与Candidametapsilosis鉴别开。PCR-RFLP技术不仅有利于常见念珠菌的鉴定，也有利于Cyberlindnerafabianii等非常见念珠菌的鉴定，为早期准确鉴定临床念珠感染提供了新的选择，具有很好的应用前景。