二代测序技术检测家族性偏瘫型偏头痛患儿的基因突变

葛丽丽，陈重芬，刘磊，郑璇，宋银森

(郑州大学附属儿童医院&河南省儿童医院&郑州儿童医院河南省儿童遗传代谢性疾病重点实验室，郑州 450018)

家族性偏瘫型偏头痛(familial hemiplegic migraine，FHM)是一种罕见的常染色体显性遗传、具有先兆症状的偏头痛[1]。本病由Clark等于1910年首次报道，是目前唯一明确的单基因遗传偏头痛，临床主要表现为发作性单侧肢体无力，后出现偏头痛伴发恶心呕吐，其他先兆症状如视觉、感觉、言语等出现异常，通常在儿童或青春期起病[2]。本研究分析1例CACNA1A基因 c.4552G>A新生突变导致家族性偏瘫型偏头痛患儿的临床及遗传学特征，为完善和丰富该病的临床-基因表型提供实验依据。

1 材料与方法

1.1一般资料 患儿，男，3岁8月龄，因“抽搐、呕吐、左侧肢体无力1 d”于2018年8月收入我院神经内科。2岁8月龄时曾出现左侧肢体无力伴呕吐，1 d后自行缓解。今再次出现相似症状，并伴视物模糊，抽搐、头痛、独坐易向左侧倾倒。为求进一步治疗，收入我院。患儿系G1P1，足月顺产，生后无窒息抢救史，出生体重2.5 kg，身长不详。母孕期体健，家族中无遗传疾病史。FHM诊断标准参照HIS《国际头痛疾病分类》(2004年)第二版：头痛先兆必须包括完全可逆的肢体乏力，必须包括完全可逆的视觉、一般感觉和语言障碍这3项症状中的1项，家族中至少有一级或二级家属有同样的症状[3]。

1.2体格检查 神志清，精神、饮食欠佳，呼吸平稳，哭闹时口角右歪，左眼闭合不全，左侧鼻唇沟变浅。左侧肢体活动障碍，右侧肢体活动无受限，关节无红肿。双侧膝腱反射、跟腱反射可引出，左侧巴氏征阳性，左上肢肌力Ⅱ级，左下肢肌力Ⅲ级，肌张力低；右侧肢体未见明显异常。

1.3实验室检查 血常规、肝肾功能、电解质、心肌酶谱均正常；头颅脑磁共振成像：右侧颞顶枕叶及右侧海马脱髓鞘改变，右侧大脑半球萎缩，右侧脑室扩张。以上均由本院相关科室完成。

1.4基因检测 经患儿监护人签署知情同意书，并经医院医学伦理委员会批准。抽取患儿及父母空腹静脉全血各2 mL，EDTA-K2抗凝，送至北京迈基诺医学检验所，按照QIAamp DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)说明书抽提基因组DNA，对患儿外显子编码区进行测序，并通过PCR扩增以及Sanger测序技术对筛选出的位点进行验证。剩余全血及DNA样本置于-20 ℃保存。以同期本院100例体检健康者作为健康人对照。

1.5突变位点的生物信息学分析 利用SIFT、PolyPhen-2软件预测错义突变对蛋白质功能的影响，应用Mutation Taster软件评估突变位点在物种间的保守性。采用SMART网站(http://smart.embl.de/)预测该蛋白质结构域和功能分析。

2 结果

2.1基因检测结果 通过全外显子组基因测序发现，患儿CACNA1A基因第28号外显子存在c.4552G>A突变。Sanger测序验证显示，其父母该位点均为野生型，患儿携带c.4552G>A突变为自发突变(图1)。而在100例健康人对照者中均未检测到该突变位点，排除其为多态性位点。

注：A，先证者携带c.4552G>A突变；B，父亲未携带c.4552G>A突变；C，母亲未携带c.4552G>A突变；箭头示突变位点。

2.2突变位点的生物信息学分析结果 c.4552G>A(p.G1518R)突变经蛋白质功能预测软件SIFT、PolyPhen-2预测结果均为“有害”(图2A、2B)；Mutation Taster物种保守性分析显示，CACNA1A蛋白第1 518位氨基酸在不同的物种间几乎完全相同，表明在进化上高度保守(图2C)。根据SMART网站预测，该位点位于CACNA1A蛋白关键结构域。

3 讨论

FHM是一种罕见的常染色体显性遗传性疾病，是先兆偏头痛(migraine with aura，MA)中的一种亚型[4]，多数在儿童或青春期起病，临床主要表现为偏头痛、可逆性单侧肢体无力及其他先兆症状如视觉、感觉、言语先兆等。李芳芳等[5]报道,一CACNA1A基因突变导致的家族性偏瘫型偏头痛家系中的患者均出现视物模糊，可逆性单侧肢体无力，持续10～20 min后自行缓解，随之出现对侧颞部疼痛，并伴恶心、呕吐、畏声、嗜睡。本例患儿出现视物模糊，10 min后出现左侧肢体无力，持续15 min后缓解，随后出现右侧颞部头痛、呕吐，并伴抽搐、哭闹时口角右歪，左眼闭合不全，左侧鼻唇沟变浅等临床症状。其临床表现与上述文献[4-5]报道的FHM的临床表现相一致。

本研究采用外显子组基因测序发现，患儿CACNA1A基因第28号外显子存在c.4552G>A突变，该突变导致第1 518位氨基酸由甘氨酸变异为精氨酸，为错义突变，经数据库检索，c.4552G>A突变未出现在EXAC、ESP6500及千人基因组计划数据库中，在100例健康人对照者中均未检测到该突变，排除其为多态性位点。Sanger测序验证显示，其父母该位点均为野生型，患儿携带c.4552G>A突变为自发突变。研究证实，50%～75%的FHM是由CACNA1A基因突变所致[6-7]，已报道的CACNA1A基因突变形式有15种，且均为错义突变。本实验中检测到的CACNA1A基因p.G1518R突变为国内外尚未报道过的新突变，经蛋白质功能预测软件SIFT、PolyPhen-2预测结果均为“有害”。 根据SMART网站预测，CACNA1Ac.4552G>A突变导致第1 518位氨基酸由甘氨酸变异为精氨酸，该突变位点位于CACNA1A蛋白的关键结构域(ion trans domain)中，该结构域具有279个氨基酸，对应的氨基酸位点为1 243至1 521位,主要参与膜结构的形成、离子跨膜运输过程以及离子通道活性。根据Mutation Taster软件预测突变位点的致病性，得出结论:这一突变位点的改变，会引起蛋白质氨基酸序列改变，可能会影响该蛋白质的结构和功能。

注：A，SIFT软件预测值为0.14；B，PolyPhen-2软件预测结果为0.997和0.960；C，Mutation Taster软件预测该位点在不同的物种间完全相同；各缩写含义:A，精氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，蛋氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸； Y，酪氨酸。

图2该突变位点的生物信息学分析

为进一步判定该位点的致病性，根据美国遗传学与基因组学学会(ACMG)发布的《ACMG遗传变异分类标准与指南》，该突变具备1个PS(突变位点为自发突变)+1个PM(在正常人群数据库中的频率为“-”，为低频)，初步判定为“Likely pathogenic”。经蛋白质功能预测软件SIFT、PolyPhen-2预测结果均为“有害”，Mutation Taster物种保守性分析显示，CACNA1A蛋白第1 518位氨基酸在不同的物种间几乎完全相同，表明其在进化上高度保守。

FHM是一种遗传因素明显的MA，临床出现可逆性的单侧肢体无力，继而发生偏头痛，恶心呕吐等表现时，应早期进行基因检测，明确病因，及时治疗并控制发作。综上所述，本研究发现的CACNA1A基因c.4552G>A突变为国内首次报道的新突变，丰富了CACNA1A基因的突变谱，提高了临床医师对家族性偏瘫型偏头痛的认识，为FHM患儿的诊断和遗传咨询提供了重要线索。