甘露聚糖酶AfMan5A和RmMan134C的性质差异分析及对多糖的协同降解

刘 学，卢海强，王玉印，田洪涛，谷新晰

（河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071000）

β-甘露聚糖酶（EC3.2.1.78）是一类水解甘露聚糖中β-1,4-D-吡喃甘露糖苷键的内切酶[1]，在食品、养殖业、造纸、生物燃料等领域应用广泛[2]。甘露聚糖酶主要来自细菌[3]、真菌[4]及放线菌等微生物[5-6]，依据氨基酸序列和结构差异可分为4 类，即GH5、GH26、GH113和GH134家族。目前GH5家族甘露聚糖酶的研究报道较多，是主要的商业用酶。2015年，GH134家族甘露聚糖酶首次在构巢曲霉（Aspergillus nidulans）中获得[7]，是分子质量最小的一类甘露聚糖酶。研究表明GH5、GH26和GH113家族的甘露聚糖酶有较大相似性，同属于GH-A超家族，具有典型的(β/α)8-磷酸丙糖异构酶（triosephoaphate isomerase，TIM）桶状结构并遵循异头碳构象保留型催化机制，而GH134家族甘露聚糖酶则表现出明显差异，显示出类似溶菌酶的折叠并采用异头碳反转型催化机制[8-9]。探究不同家族酶的性质差异可为甘露聚糖酶的具体应用提供借鉴，如Freiesleben等[10]表征了真菌来源的GH5和GH26家族甘露聚糖酶的性质，表明GH26家族甘露聚糖酶的最适pH值在5～7范围内，最适反应温度在50～68 ℃之间，而GH5家族甘露聚糖酶的最适pH值为3～6，最适反应温度为78～87 ℃，且与GH26家族的甘露聚糖酶相比，其热稳定性强；此外在降解甘露聚糖的过程中，发现GH5家族甘露聚糖酶的初始速率均低于GH26家族的甘露聚糖酶，但两个家族酶的底物特异性没有显示出明显差异。Tailford等[11]发现，来自芽孢杆菌（Bacillus）的GH5和GH26家族甘露聚糖酶的亚位点对底物所含糖单元的识别与催化有严格特异性，其中来自琼脂芽孢杆菌（Bacillus agaradhaerens）的BaMan5A在其－2和+1亚位点可容纳葡萄糖或甘露糖，而来自枯草芽孢杆菌（B. subtilis）的BsMan26A在其负结合位点对甘露糖有严格的特异性。然而，作为结构和催化机制存在巨大差异的GH5和GH134家族β-甘露聚糖酶的差异分析鲜有报道。

多糖结构复杂，分子质量大、黏度高、水解困难，其完全降解需要多个酶的协同作用。对于甘露聚糖酶，已发现存在同质协同和异质协同两种协同水解方法[12]。其中同质协同是两种主链切割酶（如甘露聚糖酶、甘露糖苷酶）或两种侧链切割酶（如乳糖苷酶、乙酰甘露聚糖酯酶）之间的协同作用，异质协同则是一个主链切割酶和一个侧链切割酶（如甘露聚糖酶和半乳糖苷酶）之间的协同作用[13-14]。Han Yejun等[15]研究表明细菌Caldanaerobius polysaccharolyticus来源的Man5A-TM1和Man5A-TM2对β-甘露聚糖和瓜尔豆胶的降解有协同作用，Man5A-TM1和Man5B对β-甘露聚糖和羧甲基纤维素的降解有协同作用，还原糖含量增加。Chen Xi等[3]发现Bacillus来源的BaMan5A与商业α-半乳糖苷酶水解半乳甘露聚糖时显示有协同作用，最大协同系数可达1.58。因此采用复合甘露聚糖酶协同降解多糖，对提高多糖的水解效率有重要意义。

本研究拟从烟曲霉（A. fumigatus）HBHF5和微孢根霉（Rhizopus microsporus）GZHF10中克隆表征GH5和GH134家族甘露聚糖酶（AfMan5A和RmMan134C），探究两者在酶结构、酶学特性、底物特异性和底物亲和力方面的差异，并开展酶协同降解多糖的研究，旨在为GH5和GH134家族甘露聚糖酶的高效催化提供一定理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株A. fumigatusHBHF5、R. microsporusGZHF10、毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115、质粒pET30a（+）和pPIC9K由本课题组筛选并保存[16]；感受态大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、E. coliBL21（DE3） 北京博迈德基因技术有限公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、RNA提取试剂盒 美基生物科技有限公司；Taq酶、限制性内切酶 日本TaKaRa公司；His标签蛋白纯化试剂盒 碧云天生物技术有限公司；魔芋粉、刺槐豆胶、瓜尔豆胶、角豆胶、壳聚糖 源叶生物有限公司；微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、果胶、甘露糖 北京索莱宝科技有限公司；皂角米多糖由本实验室提取并保存；其他试剂为国产分析纯。

诱导培养基：0.5% (NH4)2SO4、0.1% KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O、0.001% FeSO4·7H2O、0.02% CaCl2、0.3%酵母浸粉、0.3%魔芋粉；BMGY/BMMY培养基：1%酵母浸粉、2%蛋白胨、1.34%无氨基酸酵母氮源（含硫酸铵）、4×10－5%生物素、1%甘油、0.5%甲醇；LB培养基：0.5%酵母浸粉、1%胰蛋白胨、1%氯化钠，固体培养基添加2%的琼脂。

1.2 仪器与设备

T100TM聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 伯乐生命医学产品有限公司；SPX-250B-Z恒温培养箱 上海博远实业有限公司；ZWY-2102C恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司；Universal 320高速冷冻离心机 德国Hettich公司；SCIENTZ-IID超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；HH-2数显恒温水浴锅 金坛市杰瑞尔仪器厂；TU-1810紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；DW-86L388J超低温冰箱 海尔智家股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生物信息学分析

使用MEGA7.0软件对AfMan5A（AFUA_7G01070）、RmMan134C（ORE23177.1）及其他GH5、GH26、GH113和GH134家族β-甘露聚糖酶的蛋白序列进行比对，并构建系统进化树[17-18]。采用软件ProtParam（https://www.expasy.org/resources/protparam）分析蛋白质理化性质，PredictProtein（https://predictprotein.org/）分析蛋白质二级结构。选择与AfMan5A序列一致性为70.35%的晶体结构（PDB:3wh9）和与RmMan134C（PDB:5xxa）序列一致性为77.78%的晶体结构为模板，使用SWISSSMODEL软件模拟构建蛋白结构，使用The ConSurf Server（https://consurf.tau.ac.il/）分析蛋白保守序列，并通过软件Pymol进行蛋白保守序列的可视化分析，氨基酸残基以梯度着色。

1.3.2 重组甘露聚糖酶基因的克隆与载体构建

菌株A. fumigatusHBHF5和R. microsporusGZHF10分别接种至诱导培养基中，45 ℃培养3 d，离心收集菌体备用。采用RNA提取试剂盒提取总RNA，－80 ℃保存备用。利用引物进行PCR扩增获得AfMan5A和RmMan134C基因，并将获得的基因分别构建重组质粒pPIC9K-AfMan5A和pET30a-RmMan134C。引物AfMan5APF（GGGGAATTCCCCAGCGCAAAGAAATTCG）、AfMan5A-PR（GAATGCGGCCGCCTAAA CCCACCCCTGCTTC）、RmMan134C-PF（GGGGAATTCAGGCCCGGCGATAGAGGCC）、RmMan134C-PR（GAATGCGGCCGCTTAAATAGCGGTAA CGTCGACCCAG），由金唯智生物科技有限公司合成。

1.3.3 重组甘露聚糖酶酶液的制备及纯化

质粒pPIC9K-AfMan5A经限制性内切酶BglII线性化，并经纯化后电转化至GS115感受态细胞，质粒pET30a-RmMan134C热激转化至E. coliBL21（DE3）。分别参照酵母表达手册和pET系统手册筛选阳性转化子。AfMan5A的阳性转化子经 BMGY培养基摇床培养48 h后，菌泥重悬于50 mL BMMY培养基中，继续培养72 h，并加入甲醇进行诱导，保持甲醇终体积分数为0.5%。RmMan134C的阳性转化子接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，直至OD600nm为0.5～0.8时，加入1/1 000的1 mol/L异丙基硫代半乳糖苷，进行诱导表达。

采用His标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白，并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）进行结果分析。

1.3.4AfMan5A和RmMan134C酶活力测定

参考Miller[19]的方法，采用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法测定甘露聚糖酶酶活力。将100 μL适当稀释的酶液加入到900 μL的0.25%魔芋底物溶液中，摇匀后50 ℃水浴20 min，加入1.5 mL的DNS试剂终止反应，煮沸5 min后冷却至室温，在540 nm波长处测定OD值。酶活力单位（U）：该反应条件下，每分钟生成1 μmol甘露糖所需的酶量。

1.3.5 温度和pH值对酶活力的影响

在10、20、30、40、50、60、70、80、90 ℃和100 ℃条件下测定重组酶的最适反应温度，以最高酶活力为100%，计算不同温度下的相对酶活力。在50 ℃下处理AfMan5A和RmMan134C的酶液0～60 min，按标准方法测定酶活力，分析其热稳定性。以未经处理的酶溶液作对照，其酶活力定为100%。

用100 mmol/L的pH 2～3甘氨酸-盐酸缓冲液、pH 3～8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和pH 8～12甘氨酸-氢氧化钠缓冲液溶解的底物，按标准方法测定AfMan5A和RmMan134C酶活力，以最高酶活力为100%，计算不同pH值下的相对酶活力。使用上述缓冲液适当稀释酶液，于0 ℃处理酶液1 h，按标准方法测定酶活力，分析其pH值稳定性。以最适pH值处理的酶溶液作对照，其酶活力定为100%。

1.3.6 金属离子对酶活力的影响

分析金属离子（Mg2+，Ca2+，Fe3+，Cu2+，Zn2+，Li+，Na+，K+，Mn2+）对酶活力的影响。在标准酶活力反应体系中，加入金属离子，使其终浓度为1 mmol/L和5 mmol/L，以未处理为对照组，其酶活力定为100%，计算不同金属离子处理酶溶液的相对酶活力。

1.3.7AfMan5A和RmMan134C的蛋白含量测定

参照Bradford[20]方法，以牛血清蛋白为标准，用考马斯亮蓝法测定酶液的蛋白含量。

1.3.8AfMan5A和RmMan134C底物谱和底物亲和力的差异分析

以蛋白质量浓度为（1±0.04）mg/mL的酶液进行底物谱和底物亲和力分析。用pH 5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制1.25 g/L的魔芋粉、皂角米多糖、刺槐豆胶、瓜尔豆胶、角豆胶、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、壳聚糖和果胶底物，按照标准方法，分别在最适反应温度条件下测定酶活力，分析底物特异性。

取底物溶液4 mL，加入2 mL蛋白质量浓度为（1±0.04）mg/mL的酶液，于4 ℃、25 r/min条件下混匀8 h，12 000 r/min离心5 min取上清液，以1.25 g/L的魔芋粉为底物，未与底物结合酶液的酶活力定为100%，在最适反应条件下测定它和上清液的酶活力，计算两者差值，分析底物结合的亲和力[21]。

1.3.9AfMan5A和RmMan134C的协同酶解多糖分析

取1.3.8节配制好的底物溶液，按照标准方法，将相同蛋白质量浓度（（1±0.04）mg/mL）的酶液在各自最适反应温度下反应，中途煮沸20 min灭活酶液，对照组为单个酶液反应，并添加100 μL蒸馏水代替酶液。测定AfMan5A和RmMan134C三种协同反应，包括两者同时反应、AfMan5A先反应和RmMan134C先反应。以甘露糖标准曲线计算对照组和双酶协同组的还原糖含量，以协同系数判定AfMan5A和RmMan134C的协同降解作用。协同系数为协同组的还原糖含量值与对照组还原糖含量相加值的比值，协同系数小于1说明无协同作用，大于1有协同作用，且随着比值的增加，协同作用显著[22]。

1.4 数据统计

每个实验重复3 次，使用GraphPad Prism 8.0.1、Excel 2010和SPSS Statistics 17.0对数据进行分析，结果以进行评估。

2 结果与分析

2.1 AfMan5A和RmMan134C的生物信息学分析及表达

由4 个家族甘露聚酶的进化树结果可知（图1），甘露聚糖酶按照家族各自构成一个分支，同时发现，GH134家族甘露聚糖酶与其他3 个家族的β-甘露聚糖酶相比，亲缘关系较远。这与GH5、GH26和GH113家族的β-甘露聚糖酶属于同一超级家族（GH-A）有关，都遵循保留型催化机制，而GH134家族甘露聚糖酶则采用异头碳反转型催化机制。

图1 GH5和GH134家族β-甘露聚糖酶的系统进化树及结构分析Fig. 1 Phylogenetic tree and structure analysis of β-mannanase from the GH5 and GH134 families

经同源建模分析AfMan5A由8 个α-螺旋及8 个β-折叠交替排列形成了TIM桶状结构，排列在一起的8 个β-折叠片段形成桶状内部凹槽结构，与之相连接的α-螺旋则组成桶的外沿，其中有54.96%的无规卷曲结构、31.1%的α-螺旋结构、13.94%的β-折叠结构。并由8 个保守氨基酸残基构成了该桶状的活性口袋，分别是R76、H124、N191、E192、H265、Y267、E300及W330，其中第4个及第7个β-折叠的C末端是2 个高度保守的谷氨酸残基（E192和E300），是β-甘露聚糖酶的亲核催化及酸碱催化位点[23-24]。RmMan134C由9 个α-螺旋及2 个反向平行的β-折叠组成，其中无规卷曲结构占65.03%、α-螺旋结构占27.32%、β-折叠结构占7.65%。分析RmMan134C的氨基酸序列，发现E55和D67是其活性催化位点，此外173～183位的氨基酸（DTRFWVDVTAI）组成了RmMan134C最短的保守区，且该区域相对而言最为保守，主要是β-折叠片结构，推测可为RmMan134C的蛋白分子机构稳定提供保障。

甘露聚糖酶AfMan5A基因全长1 119 bp，编码373 个氨基酸，蛋白质分子质量约为41.31 kDa，含28 个碱性氨基酸和38 个酸性氨基酸，等电点为5.52，不稳定系数为16.54。RmMan134C基因由549 bp碱基组成，编码183 个氨基酸，蛋白质分子质量约为20.71 kDa，含21 个碱性氨基酸和21 个酸性氨基酸，等电点为6.91，不稳定系数为26.39。图2为AfMan5A和RmMan134C的蛋白电泳图，其分子大小均大于理论值，推测是由于具有糖基化位点[25]和N端的His标签引起[26]，仍需进一步研究。

图2 重组酶AfMan5A和RmMan134C的SDS-PAGE图Fig. 2 SDS-PAGE pattern of recombinant AfMan5A and RmMan134C

2.2 AfMan5A和RmMan134C的酶学性质差异

2.2.1 温度和pH值对酶活力的影响

如图3所示，AfMan5A的最适温度和最适pH值为60 ℃和6.0，RmMan134C的最适温度和最适pH值为35 ℃和5.0。AfMan5A在50 ℃热处理1 h后，可保持（90.0±2.7）%的残余酶活力，RmMan134C在50 ℃热处理1 h后，可保持（13.2±2.6）%的残余酶活力。pH值稳定性结果显示，AfMan5A在pH 3.0～9.0范围内，酶活力较稳定，显示出80%以上的残余酶活力，RmMan134C在pH 6.0～9.0范围内，酶活力较稳定，显示出60%以上的残余酶活力。结果表明，AfMan5A属于高温酶，RmMan134C属于中温酶，热处理结果显示，较高的温度条件下，AfMan5A的热稳定性优于RmMan134C。pH值测定结果发现，两者均为偏酸性酶，在酸性和中性pH值范围内均有较好的耐受性。

图3 重组酶AfMan5A和RmMan134C的最适温度（A）、温度稳定性（B）、最适pH值（C）及pH值稳定性（D）Fig. 3 Optimum temperature (A), temperature stability (B), optimum pH (C) and pH stability (D) of recombinant AfMan5A and RmMan134C

2.2.2 金属离子对酶活力的影响

通过分析不同金属离子对AfMan5A和RmMan134C酶活性的影响（表1），发现金属离子Cu2+、Zn2+、Mn2+均可抑制两个酶的酶活力，且Cu2+和Mn2+的抑制作用比Zn2+强，但对两个酶的抑制程度有差别，5 mmol/L的Cu2+、Zn2+和Mn2+对AfMan5A的抑制率为53.2%、21.2%和86.6%，对RmMan134C的抑制率为16.5%、7.6%和70.8%。根据显著性分析结果，Mg2+、Ca2+、Fe3+、Li+、Na+、K+可提高AfMan5A的酶活性，其中Ca2+的促进效果最为明显，可提高175%的酶活力，而这些金属离子除Fe3+、5 mmol/L的Mg2+和Li+对RmMan134C酶活性有轻微抑制作用外，其余的金属离子对RmMan134C酶活力影响不大。数据表明，AfMan5A和RmMan134C对金属离子耐受性较好。

表1 金属离子对AfMan5A和RmMan134C相对酶活力的影响Table 1 Effects of metal ions on the activity of AfMan5A and RmMan134C%

2.3 酶的底物特异性及亲和力分析

甘露聚糖酶AfMan5A和RmMan134C对多种底物均表现出一定的水解活性，结果如表2所示。AfMan5A对甘露聚糖底物的特异性强，可水解魔芋葡甘露聚糖及皂角米、刺槐豆胶、瓜尔豆胶和角豆胶来源的半乳甘露聚糖，对纤维素和醛酸类底物没有显示出降解能力。RmMan134C较AfMan5A具有更宽的底物谱，对甘露聚糖、纤维素和醛酸类底物均显示出降解活性，最适底物为魔芋葡甘露聚糖，这一结果与微孢根霉来源的RmMan134A不同，它对刺槐豆胶（100%）有高酶活性，其次是魔芋（39.4%）和瓜尔豆胶（21.9%）[27]。

表2 重组酶AfMan5A和RmMan134C的底物特异性和亲和力分析Table 2 Substrate specificity and affinity analysis of AfMan5A and RmMan134C

一般来说，酶的水解速率和酶与底物的吸附能力有关，酶与底物亲和力越大，酶催化效率越高，因此，分析酶的底物亲和力可能会对酶与底物结合机制及在底物降解过程中与其他酶协同作用提供新的见解。由表2可知，AfMan5A对角豆胶的亲和力最小，RmMan134C对刺槐豆胶的亲和力最小，但均对魔芋葡甘露聚糖显示出最高的亲和力，这与魔芋葡甘露聚糖是AfMan5A和RmMan134C的最适底物结果一致。其中米曲霉来源的AoMan134A[28]酶解魔芋粉（kcat/Km=564 mL/（s·mg））时的动力学参数大于刺槐豆胶（kcat/Km=527 mL/（s·mg））和瓜尔豆胶（kcat/Km=77 mL/（s·mg）），也表现出相同结果。此外AfMan5A和RmMan134C对羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、壳聚糖的亲和力相近，但AfMan5A对皂角米多糖、刺槐豆胶、瓜尔豆胶和果胶的亲和力大于RmMan134C。

2.4 AfMan5A和RmMan134C的协同酶解

由图4可知，AfMan5A和RmMan134C同时降解魔芋粉、皂角米多糖、刺槐豆胶、瓜尔豆胶和角豆胶底物，协同系数均小于1，显示无协同效果。而进一步探究AfMan5A和RmMan134C反应的先后顺序对协同作用的影响，结果显示AfMan5A和RmMan134C按不同的先后顺序反应时，协同组的还原糖含量仍小于对照组还原糖含量相加值，因此，结果表明AfMan5A和RmMan134C对甘露聚糖类底物无协同作用。以羧甲基纤维素钠或壳聚糖为底物时，发现AfMan5A先反应时显示有协同效果，协同系数分别为1.29和4.19。在降解微晶纤维素底物时，AfMan5A先反应或后反应，结果均显示有协同作用，协同系数为分别为6.10和1.14，且AfMan5A先反应时，与其他底物的降解效果相比，其还原糖含量值最高，协同效果最显著。结果表明，AfMan5A和RmMan134C对甘露聚糖类底物无协同作用，对纤维素类底物有协同作用，且协同效果与酶液反应的先后顺序有关。因此对于纤维素类底物的降解，AfMan5A和RmMan134C可作为新的酶制剂选择，高效应用于实际生产。

图4 AfMan5A和RmMan134C对多糖的协同酶解作用Fig. 4 Synergistic hydrolysis of AfMan5A and RmMan134C on polysaccharides

3 讨 论

GH5家族的β-甘露聚糖酶分子质量在30～70 kDa之间，具有典型的(β/α)8-TIM桶状结构，催化机制为保留型。与AfMan5A相比，来源于黑曲霉（A. niger）AEY76082.1、宇佐美曲霉（A. usamii）ADZ99027.1和硫色曲霉（A. sulphureus）ABC59553.1的甘露聚糖酶α-螺旋结构占31.85%、33.94%和31.07%，β-折叠结构占19.06%、18.80%和20.63%，且等电点为4.45、4.38和4.19，均属于酸性蛋白质。目前已报道的4 个GH134家族的β-甘露聚糖酶分子质量小，为20 kDa左右，催化机制为反转型，与GH5家族相比差异显著。分析蛋白结构发现，来自于构巢曲霉（A. nidulans）AnMan134A[7]、米曲霉（A. oryzae）AoMan134A[28]、链霉菌属（Streptomycessp.）SsGH134[5]和RmMan134A[27]的甘露聚糖酶α-螺旋结构与β-折叠结构的占比差异较大，其中AoMan134A的α-螺旋结构（46.33%）与β-折叠结构的占比（8.47%）相差最大，为37.86%，同时AoMan134A的α-螺旋结构占比也最大。此外，GH134家族的β-甘露聚糖酶等电点在5.5～7.5之间，与GH5家族的β-甘露聚糖酶相比也具有较明显差异。His标签分子质量低，其中His中的咪唑环可与金属离子如Ni2+、Zn2+等特异性结合，被广泛应用于蛋白质的纯化，但也会破坏蛋白质构象，降低酶的活性和稳定性[29]。Halliwell等[30]将His标签融合到嗜热脂肪芽孢杆菌（B.stearothermophilus）L-乳酸脱氢酶的N端或C端，结果表明与野生型和N-末端标记的酶相比，C-末端标记的酶显示出较低的活性。而Esen等[31]构建了N端和C端His标记的嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum）的甲酸脱氢酶（CtFDH），发现蛋白质的溶解度不受标签位置的影响，但与N-CtFDH相比，C-CtFDH 的比活性高约3 倍，催化效率高2 倍。因此关于His标签对AfMan5A和RmMan134C酶活力的影响仍需进一步研究。

大量研究指出微生物来源的β-甘露聚糖酶最适温度在40～60 ℃之间，且一般来源于嗜热微生物的酶最适反应温度较高，如来源于A. nigerManBK[32]、蓝状菌（Talaromyces leycettanus）Man5A[33]、小巢状曲霉（A. nidulans）Man5XZ7[34]的GH5家族嗜热β-甘露聚糖酶的最适温度分别为80、90、80 ℃。然而本研究的RmMan134C与这些嗜热菌来源酶有很大不同，其最适温度为35 ℃，属于低温酶，这可能与RmMan134C的氨基酸组成和蛋白结构有关，而且RmMan134C最适温度与其他报道的GH134家族β-甘露聚糖酶相近，如AnMan134A、AoMan134A、SsGH134和RmMan134A的最适温度分别为30、30、40、50 ℃。比较酶的最适反应pH值，发现不同来源的β-甘露聚糖酶pH值差异也较大，一般真菌来源的酶最适反应pH值偏酸性，细菌来源的酶最适反应pH值偏碱性或中性，测定结果表明，AfMan5A和RmMan134C的最适反应pH值分别为6.0和5.0，无较大差异，且与多数真菌来源的酶最适pH值相似。值得注意的是，在降解魔芋葡甘露聚糖底物时，发现RmMan134C的比活力（0.31 U/mg）大于AfMan5A（0.21 U/mg），因此，相比于GH5家族的甘露聚糖酶，GH134家族甘露聚糖酶的催化能力更为明显。

与多糖相比，寡糖分子质量低，黏度低、生物活性高。目前酶解法因特异性强、条件温和、绿色环保等优点，已成为制备寡糖的首选方法[35]。此外，由于多糖结构复杂，难降解，因此采用复合酶协同降解多糖来制备寡糖是有必要的，可增强酶解效率和寡糖制备率[36]。本实验以AfMan5A和RmMan134C为研究对象，探讨了两个酶的不同加样顺序对多糖的协同降解效果。结果表明，AfMan5A和RmMan134C对甘露聚糖类底物无协同作用，对纤维素类底物有协同作用，且酶液反应的顺序不同其协同效果也不同，在酶解羧甲基纤维素钠和壳聚糖时，AfMan5A先反应时具有协同作用，协同系数分别为1.29和4.19，酶解微晶纤维素时，AfMan5A先反应和后反应均有协同效果，其中AfMan5A先反应时的协同效果最大，协同系数为6.10，这可能是由于多糖结构差异和酶的复杂性导致产生了不同的协同效果。

4 结 论

本研究成功从A. fumigatusHBHF5和R. microsporusGZHF10中获得GH5和GH134家族的β-甘露聚糖酶，发现两个酶的三维结构差异明显。甘露聚糖酶AfMan5A和RmMan134C的最适温度分别为60 ℃和35 ℃，也相差较大，此外金属离子对AfMan5A酶活性的影响效果明显。底物特异性和亲和力实验结果表明，两个酶的最适底物均为魔芋葡甘露聚糖，且均对魔芋葡甘露聚糖有最高亲和力，但AfMan5A对皂角米多糖、刺槐豆胶、瓜尔豆胶和果胶的亲和力大于RmMan134C。两个酶协同降解多糖时，发现对微晶纤维素、壳聚糖和羧甲基纤维素钠均显示出一定的协同作用，其中对微晶纤维素的协同效果最好。本研究分析了GH5和GH134家族AfMan5A和RmMan134C的结构及性质，以及二者协同降解多糖的能力，为β-甘露聚糖酶的实际应用提供数据支持。