不同还原糖糖基化对超声波预处理α-乳白蛋白结构和抗氧化活性的影响

卜 单，涂宗财,2,3，刘光宪，胡月明，王 辉,*

（1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.江西师范大学 国家淡水鱼加工技术研发专业中心，江西 南昌 330022；3.江西师范大学 江西省淡水鱼高值化利用工程技术研究中心，江西 南昌 330022；4.江西省农业科学院，江西 南昌 330299）

牛α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）由123 个氨基酸残基组成，分子质量约为14.2 kDa。二级结构中α-螺旋结构相对含量为26%，β-折叠结构相对含量为14%[1]。牛乳α-LA占总蛋白的5%，能够调节机体中乳糖合成，含有大量的必需氨基酸（63.2%），牛乳α-LA 74%的氨基酸序列与母乳的α-LA相同，且有6%的残基化学性质类似[2]，因而牛乳α-LA是一种适合作为婴儿食品营养成分的蛋白质。

据报道，糖基化反应和超声波处理能够调节α-LA的功能。糖基化反应主要通过还原糖与氨基或脂质氧化产物的相互作用，与化学修饰和酶修饰相比，是一种安全的蛋白修饰方法。美拉德反应可增强鱼鳞明胶的抗氧化活性[3]；Wang Xumei等[4-5]发现糖基化可以显著降低乳球蛋白的致敏性；Chen Yingjia等[6]发现美拉德改性后的β-乳球蛋白热稳定性得到改善。尽管糖基化能够改善蛋白的功能性能，但是单靠单一的修饰并不能得到满意的结果。

高强度（低频率）超声波是多被用于食物加工中。超声波协同糖基化能够更好改善蛋白质的结构和功能性质，如超声波预处理牛血清白蛋白，其糖基化程度加深，乳化性和乳化稳定性进一步增强[7]；超声作用和糖基化能破坏α-LA的结构，糖基化能显著提高α-LA的抗氧化活性[8]和降低其致敏性[9]。因此，超声预处理与糖基化结合后α-LA的构象变化与抗氧化活性有关。

然而，目前的研究主要集中在干燥状态或者湿热状态下美拉德反应法制备一种α-LA糖轭合物，关于不同糖类在干热状态下美拉德反应的α-LA资料很少，单一糖基化对蛋白功能的研究很多，不同还原糖糖基化结合超声波预处理对α-LA抗氧化活性的研究鲜见报道。因此本研究将采用食品工业中广泛应用的两种还原糖（葡萄糖（glucose，Glc）、甘露糖（mannose，Man））和一种稀有糖（阿洛糖（allose，All））与α-LA进行干热处理下的抗氧化活性研究。首先将超声技术应用于α-LA的结构扰动，然后将超声预处理后的α-LA进行糖基化。通过对蛋白一级结构、二级结构和三级结构的分析，以还原力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）阳离子自由基清除活性评价α-LA的抗氧化活性。以期为超声预处理联合糖基化诱导α-LA结构变化与抗氧化活性之间关系的研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

α-LA、D-Glc、D-All、D-Man 美国Sigma公司；蛋白分子质量Marker 北京索莱宝科技有限公司；其他试剂纯度均为分析纯或以上。

1.2 仪器与设备

JY98-IIIDN超声波细胞破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；Nano ZS90型粒度仪 英国马尔文仪器有限公司；ChemiDoc MP化学发光凝胶成像系统美国Bio-Rad公司；MTB Module电泳仪 美国伯乐公司；Synergy全功能酶标仪 美国BioTek仪器有限公司；Bio-Logic MOS 450圆二色谱仪 法国Bio-Logic公司；F-7000荧光光谱仪 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1α-LA超声样品的制备

1 mg/mL的α-LA溶液用10 mmol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer，PBS）溶解，放入超声波细胞破碎仪中进行超声处理。超声功率和时间为130 W、10 min，整个超声过程都在冰浴中进行，超声完毕后，放在4 ℃冰箱中待用。

1.3.2 糖基化样品的制备

分别取40 mg的Glc、All、Man于40 mL超声处理后的α-LA溶液中，混匀，冻干。将冻干样品置于相对湿度65%和55 ℃的糖基化反应模型中，反应6 h，反应完毕后将离心管至于4 ℃冰箱中终止反应，用PBS（10 mmol/L pH 7.4）复溶，然后采用3 kDa的超滤离心管（Millipore，BedFord，MA，USA）除去未反应的糖及盐分，为了进一步去除未结合的还原糖，将混合液移入透析袋中于4 ℃持续搅拌透析24 h，每天更换3 次超纯水，透析后，冻干。置于4 ℃冰箱中待用。天然的α-LA命名为LA；仅超声波处理的α-LA命名为ULA；Glc、All、Man糖基化修饰的α-LA分别命名为Glc-LA、All-LA和Man-LA；Glc、All、Man糖基化修饰的超声预处理α-LA分别命名为U-Glc-LA、U-All-LA和U-Man-LA。

1.3.3 Tricine-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

依次配制分离胶、夹层胶和浓缩胶，3种胶的制胶体积比为4∶1∶1。取10 μL样品（1 mg/mL）上样，以蛋白质Marker（3.3～31.0 kDa）为标准测定蛋白质的分子质量。

1.3.4 游离氨基含量测定

参照刘俊[10]的方法并作适当修改。测定时取100 μL的样品（蛋白质量浓度4 mg/mL）与2 mL邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）溶液混合，室温避光放置2 min。反应结束后，使用酶标仪在340 nm波长处测其吸光度，以在OPA试剂中加入100 μL去离子水为空白样。

1.3.5 粒径测定

参照张婧倩等[11]的方法，将所有样品稀释成0.25 mg/mL，采用马尔文激光粒度仪检测其粒径。样品于25 ℃平衡3 min，每个样品扫描3 次取平均值。

1.3.6 圆二色谱扫描

根据Yang Wenhua等[12]的方法并进行适当修改，将所有样品用超纯水稀释成0.5 mg/mL。设定参数为：光谱扫描范围190～250 nm，扫描速率60 nm/min，狭缝宽度1 nm。在室温下测定，连续扫描3 次取平均值。在http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/网站上进一步分析。

1.3.7 表面疏水性测定

参考Yang Wenhua等[13]的方法进行一定修改。1 mL样品加入5 μL 8-苯氨基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）（8 mmol/L，pH 7.4）溶液，取200 μL混合液体加入到比色皿中，利用荧光光谱仪进行荧光光谱分析，激发波长和发射波长分别为390 nm和470 nm，测量荧光强度，将荧光强度对蛋白质浓度的作图进行拟合，其斜率即为表面疏水性。

1.3.8 抗氧化活性测定

1.3.8.1 还原力的测定

参考Medjkouh等[14]的方法并作适当修改。首先将500 μL 1%的K3[Fe(CN)]6溶液与等体积的PBS（0.2 mol/L，pH 6.6）混匀，再加入500 μL 10 mg/mL样品溶液，混合均匀后于50 ℃水浴加热20 min。反应结束后放入冰浴中冷却混合溶液，再加入500 μL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液，混合均匀后再于室温8 000×g离心10 min，然后取400 μL上清液与400 μL蒸馏水和80 μL 0.1%的K3[Fe(CN)]6溶液混合，取上述混合液200 μL于酶标板上，在酶标仪上测定波长700 nm处的吸光度。

1.3.8.2 DPPH自由基清除率的测定

参考Wen Chaoting等[15]的方法并作适当修改。首先将500 μL 10 mg/mL的样品溶液与2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液混合，于室温下避光反应30 min后，取200 μL于酶标板上，在酶标仪上测定波长517 nm处的吸光度，同时以超纯水为空白对照。DPPH自由基清除率计算如下：

式中：AS为样品在517 nm波长处的吸光度；AC为对照品在517 nm波长处的吸光度。

1.3.8.3 ABTS阳离子自由基清除能力的测定

参照Chang等[16]的方法并作适当修改。7 mmol/L的ABTS和2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液等体积混匀，避光室温反应12 h备用，此为ABTS阳离子自由基工作液。将反应12 h后的ABTS阳离子自由基溶液用超纯水稀释到734 nm波长处吸光度为0.70±0.02后备用。取80 μL的样品溶液，加入3.92 mL稀释的ABTS阳离子自由基溶液，混合均匀，室温反应10 min，于734 nm波长处测定吸光度。ABTS阳离子自由基清除率计算如下：

式中：AD为样品在734 nm波长处的吸光度；AC为对照品在734 nm波长处的吸光度。

1.4 数据统计学分析

2 结果与分析

2.1 Tricine-SDS-PAGE

如图1所示，与未处理的LA（1泳道）比较，仅超声波处理的ULA条带（2泳道）未发生明显变化，超声波协同糖基化反应处理的α-LA条带（3～8泳道）明显上移，这说明糖基化后α-LA的分子质量增加，α-LA与糖分子形成共价键。

图1 不同还原糖的糖基化反应对超声波预处理α-LA分子质量的影响Fig. 1 Effect of glycation with different reducing saccharides on the molecular mass of ultrasonic pretreated α-LA

2.2 α-LA和不同还原糖糖基化反应氨基含量

以往研究表明赖氨酸是还原糖的主要糖基化位点，而精氨酸是不常见的糖基化位点，糖基化程度的增加会减少游离氨基数量[17-18]。如表1所示，与LA相比，仅ULA游离氨基含量变化不明显，但糖基化后的α-LA游离氨基含量发生了不同程度的减少，且超声预处理的α-LA游离氨基含量变化进一步增大（P＜0.05），说明超声波促进了α-LA的糖基化反应，使得糖基化反应程度进一步增大。Glc、All、Man都是六碳醛糖，结构上的唯一区别是C2和C3的构型不同，导致不同糖基化样品接枝度发生显著差异。其中，All修饰的α-LA具有最低的游离氨基含量和最高的接枝度，说明糖基化反应程度最高。这可能是由于超声波破坏了蛋白质的结构，使得蛋白构象变得松散，更有益于糖分子的接入，且All的构型更易于发生糖基化反应。Yang Yipeng等[19]研究了卵清蛋白（ovalbumin，OVA）与5种不同的单糖发生糖基化，结果显示All糖基化OVA的游离氨基含量最低。

表1 不同还原糖的糖基化反应对超声波预处理α-LA游离氨基含量的影响Table 1 Effect of glycation with different reducing saccharides on free amino contents of ultrasonic pretreated α-LA %

2.3 粒径及其分布

由图2可知，经过超声预处理和糖基化后的α-LA，平均粒径从242 nm增加到了792 nm，多分散指数（polymer dispersity index，PDI）从0.425增加到0.794。说明超声波糖基化改变了α-LA的结构，蛋白结构变得更加松散，粒径分布跨度增大。其中，All修饰的α-LA平均粒径和PDI最大，这可能是由于α-LA分子结合了更多All，这与之前的接枝度结果一致。马秋平等[20]发现因为单糖分子的接入，蛋白构象遭到破坏，使得蛋白粒径增大。胡淼等[21]发现过度的热处理会使蛋白发生聚集，导致BMPIDextran共价复合物乳液的平均粒径增大，乳化性降低。孟轩夷[22]通过粒径和电镜观察发现亚麻酸的加入能引起乳蛋白分子聚合形成高聚物增加β-乳球蛋白和α-LA的颗粒大小。

图2 不同还原糖的糖基化反应对超声波预处理α-LA平均粒径和PDI的影响Fig. 2 Effect of glycation with different reducing saccharides on average particle size and PDI of ultrasonic pretreated α-LA

2.4 二级结构分析

如表2所示，超声及糖基化处理后的α-LA二级结构含量发生了明显变化。与LA相比，α-螺旋结构相对含量减少，β-折叠增加。这与Stathopulos等[23]的结果一致，超声处理可以明显影响蛋白的二级结构，诱导蛋白聚合作用从而导致α-螺旋相对含量减少而β-折叠相对含量增加；Ma Xiaojuan等[24]的研究表明，糖基化可以使得蛋白β-折叠含量增加。由于糖基化，它可能会以β-转角或无规结构为代价增加β-折叠相对含量，将蛋白质结构的几何形状转变为更稳定的形式[13]。但是，Yang Wenhua等[25]报道，β-Lg经过糖基化修饰后α-螺旋相对含量增加，β-折叠相对含量减少，糖基化可以使得蛋白β-折叠转换为α-螺旋。不同结果可能是由于糖化反应pH值、温度、水分活度和蛋白质等条件不同所致。

表2 不同还原糖的糖基化反应对超声波预处理α-LA二级结构的影响Table 2 Effect of glycation with different reducing saccharides on secondary structures of ultrasonic pretreated α-LA%

2.5 表面疏水性分析

图3 不同还原糖的糖基化反应对超声波预处理α-LA表面疏水性的影响Fig. 3 Effect of glycation with different reducing saccharides on surface hydrophobicity of ultrasonic pretreated α-LA

如图3所示，与LA相比，糖基化样品的表面疏水性发生了不同程度的降低。这与之前研究一致，糖基化显著降低了蛋白的表面疏水性[26-27]。在这3种还原糖中，Glc修饰的α-LA表面疏水性最低。由于ANS可以强结合阳离子基团，如赖氨酸和精氨酸残基，而赖氨酸和精氨酸残基是糖基化反应的主要位点[28]。超声预处理使得蛋白质的构象发生去折叠，可促进赖氨酸和/或精氨酸残基与还原糖结合，使ANS能够结合的阳离子基团减少，最终导致其表面疏水性降低。此外，糖分子的引入增加了糖-蛋白分子表面的空间位阻和亲水性，抑制了ANS对这些疏水性基团的可及性[29]。

2.6 抗氧化活性分析

图4 不同还原糖的糖基化反应对超声波预处理α-LA抗氧化性的影响Fig. 4 Effect of glycation with different reducing saccharides on the antioxidant activities of ultrasonic pretreated α-LA

DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力可以反映超声糖基化样品的抗氧化能力。以样品在700 nm波长处吸光度表示还原力的大小。如图4A所示，超声糖基化后的α-LA还原力显著提高（P＜0.05），其中All修饰的α-LA具有最高的吸光度，且超声预处理α-LA吸光度进一步提高。超声糖基化样品DPPH自由基清除能力见图4B，与还原力的测定有相似结果，糖基化后的α-LA自由基清除能力显著提高，其抗氧化活性顺序为All＞Man＞Glc。图4C中虽然3种糖修饰的α-LA对ABTS阳离子自由基清除能力无显著差异，但是All修饰的α-LA仍具有最高自由基清除能力，且超声进一步提高其自由基清除能力，说明糖基化程度越高，蛋白抗氧化活性越强。Yang Wenhua等[12]也得到相似的结果，高强度超声预处理可增强OVAMan结合物的抗氧化活性。此外，从图4B、C可以看出，α-LA的ABTS阳离子自由基清除能力高于DPPH自由基清除能力，这说明超声预处理的糖基化α-LA水溶性较高，更易与水溶性的ABTS阳离子自由基结合，而与脂溶性的DPPH反应程度较低。

糖基化结合超声波预处理增强α-LA抗氧化活性，可能是由于糖基化反应过程中产生了一些还原酮类中间物质，能够提供氢离子等抗氧化物质，与自由基结合，形成稳定的分子[30]，而且高分子质量的美拉德反应产物具有较强的还原性[31]，使得产物的抗氧化能力显著提高。另一方面超声使得蛋白结构变得松散，更有利于糖分子的接入，糖基化程度增大，此外超声空化作用可以产生羟自由基[32]，促进糖基化反应。总之，超声波协同糖基化显著增强了α-LA的抗氧化活性，且超声波预处理促进了这种增强作用。因此，超声波协同糖基化是一种很有前景的制备食品加工抗氧化剂的方法。

3 结 论

研究发现，糖基化结合超声波预处理诱导α-LA结构变化与其抗氧化活性增强有着密切相关性。其中，All修饰的α-LA接枝度最高，抗氧化活性最强。糖基化结合超声波预处理提高了α-LA的平均粒径，扩大了粒径分布范围；改变了α-LA的二级结构，提高了β-折叠相对含量，降低了α-螺旋相对含量；改变了α-LA的三级结构。因此，糖基化结合超声波预处理是一种很有前景的提升α-LA功能特性的方法。然而，在此条件下糖基化结合超声波预处理增强α-LA抗氧化活性的机制需要进一步深入研究。