两种不同质地的莲藕碱溶性果胶组分热降解规律及流变学差异

段瑞冰，李 洁，刘纪红，严守雷,3,4,*

（1.华中农业大学食品科技学院，湖北 武汉 430070；2.华中农业大学理学院，湖北 武汉 430070；3.湖北省水生蔬菜保鲜加工工程中心，湖北 武汉 430070；4.长江经济带大宗水生生物产业绿色发展教育部工程研究中心，湖北 武汉 430070）

莲藕（Nelumbo nuciferaGaertn），属于多年生莲科植物，在中国、日本、印度等东方国家作为蔬菜食用，因其具有较高的营养价值、功能特性和宜人的口感而受到消费者青睐。通常将莲藕分为粉藕和脆藕，粉藕质地粉糯，在烹饪过程中较易煮烂，而脆藕口感较脆，在烹饪过程中较难煮烂。两种藕具有不同食用方式且价格差异较大，研究它们在烹饪过程中造成质地差异的机制具有重要的理论和应用价值[1-3]。

有研究表明细胞壁完整性是影响莲藕质地差异的重要因素[4]，但细胞壁成分复杂，较难明确是哪种化合物起重要作用，因此开始逐渐将细胞壁细化。许多研究表明作为细胞壁主要成分的果胶与果蔬的热加工质地有着密切关系[5-7]。果胶结构在植物种类、成熟阶段、不同组织甚至单一细胞壁内都极具差异，目前研究发现果胶包含4 个结构域，分别是：由线性D-半乳糖醛酸通过α-1,4糖苷键连接组成的聚半乳糖醛酸区（homogalacturonan，HG），可在C-4处甲酯化，在O-2/O-3处发生乙酰化，根据酯化度可分为高甲氧基果胶和低甲氧基果胶；由鼠李糖和半乳糖醛酸交替连接作为鼠李半乳糖醛酸一区（rhamnogalacturonan-I，RG-I）的主链，由阿拉伯聚糖、半乳聚和阿拉伯半乳聚糖作为侧链；鼠李糖半乳糖醛酸二区作为最保守的区域，其侧链的糖种类较多，有L-岩藻糖、L-鼠李糖、D-半乳糖和L-阿拉伯糖；还有由木聚糖半乳糖醛酸组成的木半乳糖醛酸区[8-9]。根据与细胞壁连接的紧密程度和萃取溶剂可以将提取的果胶分为水溶性果胶（water-soluble pectin fraction，WSF）、螯合态果胶（chelate-soluble pectin fraction，CSF）和碱溶性果胶（sodium carbonate-soluble pectin fraction，NSF）。WSF是与细胞壁连接松散的解聚果胶；CSF是与细胞壁通过钙离子螯合连接的果胶；NSF是通过共价键与细胞壁连接最紧密的果胶。有研究显示3种果胶中占比最大的NSF在果蔬软化过程中发生了显著变化[10-11]。流变学特性是果蔬质构研究中的重要分支，包括稳态流变和动态流变。通过稳态流变学实验可以判定流体类型，通过动态流变学实验获得流体的黏弹性特征参数。影响果胶结构与其流变学特性之间关系的因素有很多，内在因素如酯化度、块状度和分支度等，外界条件如pH值、盐离子和温度等。其中，温度变化对果胶流变学特性影响的研究大多是在流变学实验过程中升温，虽然能与氢键、范德华力、离子键、果胶链热迁移率、链长和分支度等结合分析用于推测果胶结构与性质[12-14]，但在这个过程中始终无法对果胶结构变化进行可视化。

芦林湖藕和沔城藕分别是典型的脆藕和粉藕。本实验选取这两种莲藕作为实验材料并提取其NSF。在流变学实验前先对NSF进行不同温度处理，然后通过测定单糖含量变化和傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）分析推测两种藕NSF的一级结构变化，再通过原子力显微镜对两种NSF纳米结构变化进行可视化，最后对流变学实验与结构测定结果结合分析加热对两种藕NSF结构的影响，进一步了解芦林湖藕和沔城藕质构差异的分子机制，以期为探究细胞壁果胶影响果蔬热加工质地提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

两种莲藕（芦林湖藕和沔城藕）于2020年12月在湖北省仙桃市采收。经清洗、去皮、切片、打浆和除淀粉后置于-80 ℃保存备用。

间苯基苯酚、三氟乙酸、溴化钾、四硼酸钠、乙酸钠、丙酮、氯浓硫酸（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、岩藻糖、半乳糖醛酸（均为色谱纯）上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

LGJ-30F真空冷冻干燥机 北京松原华兴科技发展有限公司；BSA124S分析天平 德国赛多利斯集团；R-210旋蒸蒸发仪 瑞士Buchi公司；E2695高效液相色谱仪 美国安捷伦科技公司；722型紫外-可见分光光度计 上海兴茂仪器有限公司；Nicolet470 FTIR仪美国尼高力仪器公司；DHR-2流变仪 美国TA公司；Multimode8原子力显微镜 美国Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 NSF的提取

参考Liu Gongji等[15]通过分级提取的方法从莲藕中分离纯化NSF。加95%乙醇溶液于85 ℃水浴中加热20 min除去可溶性糖，然后加入甲醇-氯仿溶液（1∶1，V/V）振荡1 h除去脂类物质。用丙酮清洗除去有机试剂后，置于45 ℃烘箱中干燥，获得莲藕醇不溶性固形物。

向莲藕醇不溶性固形物中加入0.1 mol/L乙酸钠溶液于沸水浴中加热除去与细胞壁连接松散的WSF。加入环己二胺四乙酸在常温下振荡6 h除去与细胞壁通过离子键连接的CSF。加入0.05 mol/L碳酸钠溶液（含有0.02 mol/L硼氢化钠）在常温下振荡6 h。透析除去盐离子，醇沉并冻干，得到NSF，于-20 ℃保存备用。

1.3.2 NSF的热处理

将溶解于蒸馏水的芦林湖藕NSF（LN）和沔城藕NSF（MN）等分成4 份，分别在60、80、100 ℃水浴1 h，另一组作为对照组。然后将处理组和对照组透析24 h除去小分子物质，浓缩、醇沉并冻干后，得到8种待测样品。

1.3.3 单糖测定

用三氟乙酸水解待测样品，于110 ℃水解4 h，冷却后加入甲醇，然后用氮吹仪将管中的三氟乙酸吹出，直到管中无酸味。用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮-甲醇溶液对水解后的样品进行衍生化[16]。

采用高效液相色谱仪测定。色谱条件：ZORBAX Carbohydrate色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A为pH 6.8 0.1 mol/L磷酸钠缓冲液，流动相B为乙腈；等度洗脱：A∶B＝83∶17，流速为1 mL/min；检测器：紫外可见吸收检测器。按下式计算糖比值[17]：

1.3.4 果胶含量测定[18]

采用间苯基苯酚-硫酸法测定。将样品溶于蒸馏水得到1 mL 0.1 mg/mL样品液，加入6 mL硫酸-四硼酸钠溶液（四硼酸钠浓度为0.012 5 mol/L），混匀后置于沸水浴中加热5 min。冷却后加入间苯基苯酚溶液，振荡混匀，在520 nm波长处测定吸光度。使用D-半乳糖醛酸标准品，溶于蒸馏水，制备0、20、40、60、80、100 μg/mL系列标准溶液，测定吸光度并绘制标准曲线。

1.3.5 FTIR测定

将3 mg待测样品与300 mg KBr混合研磨，压至半透明的薄片。每个样品压3 个片，在4 000～500 cm-1内获得红外光谱，光谱分辨率为4。使用Origin 2018软件作图，校正基线、归一化至2 940 cm-1。

1.3.6 原子力显微镜测定

样品溶于蒸馏水，配置5 μg/mL的样品稀释液。向新切割的云母片上滴加5 μL样品稀释液，在常温条件下自然干燥后待测。氮化硅悬臂力常数为40 N/m，采用Tapping模式测定，扫描速率为2 Hz。

使用NanoScope Analysis 1.9离线分析软件处理图像：首先采用三阶多项式拟合进行平滑处理，去除曲面的弓形效应，使用同一组像素阈值；用“partical”模块提取NSF的高度信息。将图像导出为TIFF格式，使用Matlab 2018a软件编码并进行骨架提取和链长计算；为了保证链长的可靠性，定义一条完整链的高度几乎相同，确保没有将多条链缠结的结果作为一条链计算[19]。

1.3.7 流变学特性测定

将待测样品溶于蒸馏水中配制成30 mg/mL的待测液，于170 r/min常温振荡溶解。完全溶解后在4 ℃条件下过夜使溶液稳定。使用DHR-2流变仪进行流变学测试，选择60 mm锥板作为夹具，在0.1～1 000 s-1范围内测定果胶的稳态流变学行为，利用Ostwald-de Waele模型（式（3））计算K和n，公式如下：

式中：τ为剪切应力/Pa；K为稠度系数/（Pa·sn）；γ为剪切速率/s-1；n为流动指数。

根据n值可以将流体分为假塑型流体、膨胀型流体和牛顿流体：n＞1为剪切增稠（膨胀性）；n＜1为剪切稀释（假塑性）；n＝1为牛顿流体[20]。

动态流变学特性测定：先进行应变扫描确定线性黏弹区，通过线性黏弹区选出合适的应变（0.1%）进行动态扫描，角频率为0.1～200 rad/s，得到储能模量（G’）和损耗模量（G’），计算损耗角正切tanδ。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 不同热处理后NSF的化学组成变化

由表1、2可知，从两种莲藕中提取的NSF都富含半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖等果胶特征糖，且两者经加热后单糖含量都发生了一定变化。如表1所示，MN总单糖绝对含量整体呈减小趋势，而LN总单糖含量整体呈增大趋势，这与表3中的果胶含量变化趋势相似（标准曲线方程：y＝0.009 1x+0.013 1，R2＝0.998）。MN的总单糖含量整体呈减小趋势可能是因为提取的样品中非果胶组分如纤维素较果胶耐热性更强[21]；因此，随着温度升高，MN果胶特征糖的总绝对含量减小。LN中葡萄糖绝对含量明显高于MN，这可能是因为LN中的果胶与纤维素连接更紧密，因为LN中含有更多阿拉伯糖、半乳糖并且具有更多支链，这一结构特点使提取过程中更多纤维素随果胶被提取出来[22]。LN的总单糖含量整体呈增大趋势也可能与果胶与纤维素的连接方式有关，但是具体原因还不清楚，但是可以确定的是与NSF中其他组分相比，加热对LN中果胶组分的破坏程度小于MN。由表2可知，随着温度升高，LN和MN半乳糖醛酸的相对含量整体呈增加趋势，阿拉伯糖、半乳糖等RG-I区特征糖的相对含量整体呈减小趋势，说明RG-I区的水解程度大于HG区。表1显示总果胶特征糖含量仅占样品总量的十分之一左右，这是因为三氟乙酸对果胶仅是部分酸水解，因此所测结果均偏低，但这并不影响其变化趋势[22]。

表1 热处理MN和LN的单糖绝对含量Table 1 Change in monosaccharide contents of NSF after heat treatment

表2 热处理MN和LN的单糖相对含量Table 2 Change in monosaccharide proportions of NSF after heat treatment

表3 热处理MN和LN的果胶相对含量Table 3 Change in pectin proportion of NSF after heat treatment

2.2 不同热处理后NSF果胶组分FTIR分析

图1 热处理的MN（A）和LN（B）的红外光谱图Fig. 1 Infrared spectra of raw and heated NSF from mealy (A) and crunchy (B) lotus rhizome

将红外光谱与单糖含量结合分析，进一步表征温度处理对LN、MN一级结构的影响。如图1所示，3 440 cm-1处为—OH的伸缩振动，2 940 cm-1处为甲基和亚甲基的C—H伸缩振动；在1 730 cm-1波数附近没有出现峰，说明提取的NSF不含或者含有非常低的甲酯基，这可能因为酯基在NSF提取过程中被皂化[23]；1 620 cm-1处为未酯化的羧基，1 340 cm-1处为C—H弯曲振动，1 240 cm-1处为C—O伸缩振动，1 140 cm-1附近为C—O—C伸缩运动，1 100 cm-1处为C—C和C—O伸缩运动[24-25]。前人研究观察了不同化合物在1 000～1 200 cm-1区域的峰型，发现富含糖醛酸如半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸的样品在1 100 cm-1和1 018cm-1处出现了两个强烈峰，且NSF与其他组分相比在1 099 cm-1和1 018 cm-1处有明显的峰[26]，这在本实验中也得到了证实。由图1可知，1 015～1 100 cm-1或1 020～1 150 cm-1处的峰归为游离半乳糖醛酸；950 cm-1处可能是RG-I分子的特征峰[27]。

由图1可知，不同温度处理后的LN和MN在指纹区的峰几乎重合但是其吸收峰强度发生变化，这说明加热没有生成新的化合物但是对果胶化学组分含量的变化有影响。与LN的对照组相比，LN处理组在指纹区的吸光度明显较大，但是MN与其相反，这可能说明加热后LN中果胶绝对含量增加，而MN减小，这与表1和表3的结果一致。除此之外，MN在950 cm-1处的峰强度明显高于LN，说明MN中RG-I区的相对含量多于LN。表2也显示MN中的阿拉伯糖和半乳糖的相对含量比LN中多，这可能与流变学实验中MN经加热后假塑性增强而LN减弱有关。

2.3 不同热处理后NSF果胶原子力显微镜图像分析

图2 热处理的MN和LN的原子力显微镜图Fig. 2 Atomic force micrographs of raw and heated NSF from mealy (A) and crunchy (B) lotus rhizome

图3 不同骨架长度果胶链/聚集体的相对含量Fig. 3 Relative contents of pectin chains/aggregates with different skeleton lengths in raw and heated NSF from mealy and crunchy lotus rhizome

图4 MN（A）和LN（B）的链高比例Fig. 4 Proportions of chain height of raw and heated NSF from mealy (A) and crunchy (B) lotus rhizome

由图2～4可知，与对照组比，处理组都出现了链长变短、链高和分支度降低的现象。如图2所示，NSF在云母片上形成分支结构，这与已报道结果一致[28-30]。其中LN更类似于星型结构（具有长分支），而MN相对分支较少，多为直链结构，结合单糖的相对含量猜测这些短直链可能不仅是聚半乳糖醛酸链，也有可能是中性糖链。LN和MN的链长主要集中在50～100 nm之间（图3）；LN最长138 nm，最短16 nm；MN最长130 nm，最短22 nm，这与已报道的结果接近[31]。图4表明经加热后LN和MN的链高均降低，且LN的链高普遍比MN高；单个半乳糖醛酸分子的高度大约在（0.51±0.25）nm[32]，然而在LN和MN中均发现有高于1 nm的果胶链。有研究表明具有螺旋结构的单一果胶链的链高在1 nm左右[33]，在图5和图2C1中均有两条果胶链平行排列的现象，猜测可能是两条链的叠加经加热后被分开，但是具体两条链以何种方式结合尚不清楚。有许多研究显示NSF具有规则的连接网络[31]，但是在本实验中几乎没有观察到，所有的果胶链都呈随机分布，这为NSF的纳米结构提供了新观点。除此之外，每张图像上都存在一些聚集体，这些聚集体可能是由果胶链缠绕形成，这在樱桃、草莓及未成熟番茄果皮的NSF中也观察到[34-36]。

图5 LN60原子力显微镜三维图Fig. 5 Three-dimensional atomic force micrograph of NSF from crunchy lotus rhizome heated at 60 ℃

LN和MN随着加热温度的升高都出现了链宽增大的现象（图2），这可能是因为探针增宽效应，由于原子力显微镜的局限性，当AFM尖端的半径大于被测量分子的直径时，分子的图像与尖端轮廓易混淆，测定尺寸可能偏大[37]；也可能是经加热后果胶链结构变松散的结果，例如双果胶链的松散堆积。

2.4 不同热处理后NSF果胶流变学特性分析

流变学性质与分子结构具有密切关系，同时也是果蔬质构研究的重要分支，通过测定流变学特性可以表征和验证结构测定结果。如图6A和表4所示，从稳态流变学分析中可以看到所有样品的黏度都随剪切速率的增加而降低，流动行为指数n均小于1，因此样品都呈假塑性流体。n值越小表示假塑性越强，K值越小表示黏稠度越小。由表4可知，LN对照组的黏稠度大于MN对照组；图3和图4显示LN的链长和链高大于MN，且LN中100～200 nm的链长占比大于MN；除此之外，MN的HG大于LN（表2）；因此，结合结构分析认为黏稠度与链长、链高呈正相关，与HG呈负相关。Zdunek等[38]通过研究梨果皮细胞壁的NSF发现半乳糖醛酸含量与硬度呈负相关，这与本研究结果一致。这可能是β-消除反应引起的链长变短和游离羧基比重增加，导致分子间斥力增加，从而阻碍了果胶链之间的相互作用产生的结果[39]。由表4可知，经加热后两者的黏稠度都明显下降，令人意外的是MN的假塑性略有增加而LN的假塑性减小。结合结构分析认为LN假塑性减小可能是LN链长变短、分子质量减小的结果，因为分子质量越大其形变松弛时间越长，较小的剪切导致的形变松弛来不及恢复，在更低的剪切速率下出现了剪切稀释[39]；除此之外，也有可能是分支度减小的结果。MN假塑性增加可能是分子质量分布变宽所致，有研究表明分子质量分布越宽，假塑性越强[40]；由图5也可以看到，MN除了含有大量短链外也包含数量较少的长链，但是关于为何这些长链在热处理过程中没有被水解为短链还需进一步研究。

图6 热处理LN和MN的稳态（A）和动态（B～D）流变学行为Fig. 6 Steady (A) and dynamic (B, C and D) rheological behaviors of raw and heated NSF from mealy and crunchy lotus rhizome

表4 热处理LN和MN的幂律模型参数Table 4 Power law model parameters of raw and heated NSF from mealy and crunchy lotus rhizome

图6B、C、D均为动态学流变行为，G’＞G’和tanδ＞1表示果胶呈黏性行为，G’＜G’和tanδ＜1表示果胶呈弹性行为[41]。由图6B可知，所有样品的tanδ值均随角速率的增大而增大，说明在剪切行为下样品均从弹性状态转化为黏性状态。MN100最为特殊，在低剪切速率下，其tanδ值很小，甚至小于MN对照组，但是随着剪切速率增加，tanδ值又迅速增大并且是所有样品中最大的tanδ值，这与MN100假塑性最强的分析结果一致。低剪切速率下，低tanδ可能是因为梳形分子（具有短支链）增多，当两种分子的分子质量接近时，短分支的分子在剪切作用下更易形成凝胶[42]；另一种可能是MN中同时含有较多的短直链与长链（图3），这一特殊现象有利于凝胶的形成，但是随着剪切速率的增加，分子结构受到的破坏大于相互作用，因此最终呈黏性状态。此外，同样链长变短的LN却没有出现与MN100相似的现象，这是因为两者结构上存在差异；而从图2D2中能够看到LN100更接近一种聚集体而非长链，这种聚集体不利于分子之间的相互作用，因此其始终呈黏性状态。

3 结 论

通过系统研究热处理对来自芦林湖藕和沔城藕的NSF一级结构、纳米微观结构和流变学特性的影响，深入探讨了不同温度对LN和MN的结构影响以及两者之间的热降解差异。结果表明，LN中果胶的RG-I区相对含量比MN高，从原子力显微镜图像中也能看到LN具有较多的长支链，而MN多为短直链，这一结构差异可能是导致加热后LN中果胶绝对含量增加而MN减小的重要原因；相同点是两者的支链水解程度大于直链。LN和MN经热处理后均出现了链长变短、链高降低、分支度减小的现象。结合流变学分析得到，链长、链高、分支度与黏稠度密切相关。MN假塑性增强而LN减小，这可能与链长分布和HG有关，链长分布范围越宽，假塑性越强，支链水解程度大于直链而导致分子结构从星型状转化为梳状也可能是重要原因。本研究为果蔬热加工质地差异和NSF结构提供了一定理论依据。