生物催化法制备低聚半乳糖的研究进展

何乃莹,竺胜权,黄 金

(浙江工业大学 药学院,浙江 杭州 310014)

随着社会发展和人类膳食结构的变化,人们对肉类、乳制品摄入量不断增加,而谷物类食品的摄入量却渐次减少。膳食结构的变化直接导致了高血压、糖尿病以及各种口腔和消化系统疾病的激增。且伴随着社会老龄化的日益加重,人们对功能性食品和保健食品的需求将不断增加。低聚半乳糖作为典型的功能性食品添加剂,因其具有优良的理化性质和出色的生理功效,而极具科学研究价值和市场开发前景。

1 低聚半乳糖简介及其生理功效

1.1 低聚半乳糖简介

益生元(Prebiotics)是一类能被双歧杆菌和乳酸菌选择性利用,促进宿主健康的非消化性食品组分,对维持肠道菌群平衡有着重要作用,而拥有“最佳”的肠道菌群可增强肌体对致病菌的抵抗力,降低血氨质量分数,增强免疫,降低患癌风险[1-2]。低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,GOS)作为一种功能性低聚糖,是益生元家族中的一员,近年来倍受关注[3-5]。低聚半乳糖由2～10个半乳糖基和一个末端葡萄糖基组成,结构式为(Galactose)n-Glucose。另外,两个半乳糖基组成的半乳二糖也被认为是低聚半乳糖的一种。低聚半乳糖在自然界中的质量分数较少,仅在母乳和一些水果蔬菜中少量存在,其具有优良的理化性质和出色的生理功效,非常适宜于作为添加剂应用于食品工业[6]。此外,低聚半乳糖的安全性也得到了广泛认证,如日本已将低聚半乳糖视为特定的健康食品(FOSHU),美国将其认为是公认安全使用物质(GRAS)[7],中国则将其定义为营养增强剂和新资源食品。因此,低聚半乳糖在诸如婴幼儿配方奶粉、发酵乳、糖果产品、烘焙食品、家畜饲料和宠物食品等诸多领域有着广泛的应用,市场前景广阔。

1.2 低聚半乳糖的理化性质及其生理功效

1.2.1 理化性质

商品化的低聚半乳糖外观呈半透明的微黄色至无色,甜度适中,一般为蔗糖的0.3～0.6倍,黏度类似于高果糖浆,热值较蔗糖低,一般低于蔗糖热值的50%,由于低聚半乳糖中含有许多亲水基团,具有良好的水溶性和持水力,保湿能力强。此外,由于其结构中含有许多不易被水解的β-(1→3),β-(1→4)和β-(1→6)糖苷键,在高温以及宽pH范围内均具有较高的稳定性,如在温度37 ℃和pH 2条件下可几个月内维持稳定,在中性pH 7和温度160 ℃或pH 3和温度120 ℃条件下处理10 min,仍能保持理化性质稳定。

1.2.2 生理功效

1)非消化性。非消化性是某种组分能被定义为益生元所需具备的要素之一[1],低聚半乳糖由于其糖单元间含有许多不易水解的β-半乳糖苷键,除极少部分二糖外一般不能被肌体的消化酶所消化吸收。有研究表明[8-9]:低聚半乳糖的质量分数超过90%就不会被胃和小肠消化吸收,而是直接进入结肠;另有体外实验表明低聚半乳三糖和低聚半乳四糖不能被人体唾液中的α-淀粉酶、人工胃液和猪胰腺α-淀粉酶水解,仅有少部分二糖可以被大鼠肠道内含有的酶消化。另外,低聚半乳糖的热值很低,仅5～8 kJ/g。基于此,低聚半乳糖可以作为糖尿病人以及肥胖病人食品的甜味剂和填充剂。

2)促进益生菌增殖。低聚半乳糖可以被双歧杆菌和乳酸菌选择性利用从而促进益生菌增殖,抑制有害菌生长,维持肠道菌群平衡。Davis等[10]研究了低聚半乳糖剂量对于双歧杆菌的影响,发现日摄入含有5 g及以上低聚半乳糖的咀嚼糖果,连续3周摄入,就会产生明显的双歧杆菌增殖效应;常金金等[11]研究了断奶仔猪日粮中添加2%的低聚半乳糖可增加仔猪肠道乳酸杆菌相对丰度,改善肠道微生物组成。

3)促进矿物质吸收。双歧杆菌等益生菌可利用低聚半乳糖产生弱酸性的短链脂肪酸(乙酸、丁酸和异丁酸等)和乳酸,会降低肠道pH,促进钙、铁离子吸收,预防骨质疏松[7,11-12]。

4)预防龋齿。低聚半乳糖不能被口腔链球菌利用,可以减少口腔链球菌的产生,达到预防龋齿的作用。同时,低聚半乳糖又具有甜度,可以将其应用于儿童食品甜味剂或生产防龋齿糖果中,降低儿童龋齿的发生率。

5)预防、治疗便秘。低聚半乳糖被双歧杆菌发酵分解后产生的短链脂肪酸及CO2,H2和CH4等气体,能刺激肠道的蠕动,增加粪便的湿润度,防止便秘的发生。

6)其他。低聚半乳糖在免疫机制调节、调节脂质代谢和抑制肿瘤细胞生成等方面也发挥着重要作用[12-14]。低聚半乳糖亦被发现可以选择性刺激人皮肤上的“有益”细菌,同时其作为化妆品添加剂,具有一定的保湿功效和祛痘功效[15]。另外,研究发现了肠道菌群环境的改变,可能导致抑郁症、肥胖症、阿尔兹海默病和帕金森氏病等疾病的发生。由于低聚半乳糖有益肠道菌群调节,其生理功效也引起制药领域研究人员的广泛关注。

2 低聚半乳糖的制备

目前,国内外研究表明:低聚半乳糖的制备方法主要有从天然原料(如天然多糖的酸水解)中提取、化学合成法、发酵法和酶法(生物催化法)。由于天然原料中低聚半乳糖的含量很低,如蜂蜜、一些水果蔬菜和动物乳汁中含有微量的低聚半乳糖,且只有母乳中含量稍多,因此从天然原料中提取大量低聚半乳糖并不现实,天然多糖酸水解时,低聚半乳糖产率不高,且水解产物成分复杂,含有大量的其他非功能性单/寡糖,分离纯化困难,不适合大规模的工业化生产。化学合成法制备低聚半乳糖污染大,成本高,生态效益和经济效益均不高,也不适合工业化生产。低聚半乳糖合成方法中研究较多的是发酵法和酶法合成,而酶(β-半乳糖苷酶)法制备以其特异性的转糖基活性优点,成为目前工业化生产低聚半乳糖的主要方法[16-17]。

2.1 酶法合成低聚半乳糖的机理

β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的机理为

其中:E为β-半乳糖苷酶;ROH为糖基受体。

β-半乳糖苷酶利用其水解活性将底物乳糖分解为半乳糖基和葡萄糖基,再利用β-半乳糖苷酶的转糖基活性将半乳糖基转移至不同的受体,当半乳糖基的受体为水时,形成半乳糖,当半乳糖基的受体为其他糖基受体时,则形成低聚半乳糖。因此,β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的反应是一个伴随着水解与合成的动力学控制反应[18]。

2.2 β-半乳糖苷酶、来源及其合成低聚半乳糖

2.2.1β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶(E.C.3.2.1.23),别称乳糖酶,是一类能水解β-半乳糖苷键的糖苷水解酶类[4,19],已应用于食品、生物传感器和基础研究等领域。在食品工业领域,通常利用β-半乳糖苷酶的水解活性来降解乳制品中的乳糖,生产低乳糖乳制品,改善乳制品的消化率、溶解度、甜度和风味等,并降低乳糖带来的乳糖不耐受症状的风险[4]。研究表明:世界上有将近70%的成人患有乳糖不耐受症[8],此外也可以将其用于乳清废水的处理以减少环境污染[20-21]。在生物传感器领域,也有一些β-半乳糖苷酶被应用于生物传感器中用来检测乳制品中的乳糖[22]。在基础研究领域,编码β-半乳糖苷酶基因(lacZ)经常被用作报告基因,用于监测转染率[4]。更为有趣的是,β-半乳糖苷酶除了具有水解活性外,部分来源的β-半乳糖苷酶还具有转糖基活性,可用来合成作为益生元的低聚半乳糖,是其在食品工业上的又一主要用途。

2.2.2β-半乳糖苷酶的来源

β-半乳糖苷酶的来源十分广泛,其主要来源有:1)植物来源。如拟南芥、番茄、草莓、甜椒、苹果、芒果和香蕉等[23];2)动物来源。主要存在于幼小哺乳动物的小肠中;3)微生物来源。细菌(如大肠杆菌、乳酸菌和双歧杆菌等)、霉菌(如米曲霉、黑曲霉和青霉等)、酵母(如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母等)和放线菌(如天蓝色链霉菌)[5,8]。动植物来源的β-半乳糖苷酶质量分数较少,且分离提取困难,不适合工业化生产;而微生物来源的β-半乳糖苷酶以其产量高、成本低和周期短等优点,成为工业化生产的主要来源,黑曲霉、米曲霉、克鲁维酵母、双歧杆菌和环状芽孢杆菌为β-半乳糖苷酶工业化生产的主要酶源[5,24]。不同来源的β-半乳糖苷酶在其蛋白序列、分子质量、结构以及酶学性质等方面差异显著,依据β-半乳糖苷酶蛋白序列的相似性,搜索生物信息学数据库CAZy(http://www.cazy.org/),β-半乳糖苷酶可被细分为GH1,GH2,GH35,GH42,GH59和GH147等多个糖苷水解酶家族。已报道具有工业化应用潜力的有GH1,GH2,GH35以及GH42家族,不同来源的β-半乳糖苷酶家族及活性特征如表1所示。

表1 不同来源的β-半乳糖苷酶家族及活性特征

2.2.3β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖

近年来,随着低聚半乳糖的益生效果逐渐被人们所熟知,有关低聚半乳糖的研究已成为国内外学者关注的热点。目前,国内外已有大量关于β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的报道。β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的方式主要有利用野生菌β-半乳糖苷酶粗酶或纯酶[32-33]、重组β-半乳糖苷酶[34-35]、微生物全细胞或渗透化细胞[30-36]、固定化酶或细胞[37,29]来催化乳糖水解和转糖基过程,实现低聚半乳糖的生物催化法制备。采用游离酶合成低聚半乳糖的优点是游离酶直接参加反应,产物纯度高、易纯化;缺点是酶用量大,稳定性不高。此外,野生菌的β-半乳糖苷酶分离纯化困难,成本高,但生物安全性高,而重组工程菌的β-半乳糖苷酶较野生酶更为简单易得。固定化酶合成低聚半乳糖较游离酶稳定性高,且能重复利用,是低聚半乳糖工业化生产研究的焦点。

由于β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的反应是伴随着水解与合成的动力学控制反应,β-半乳糖苷酶的性质(酶源)对低聚半乳糖生物催化法高效制备至关重要,如低聚半乳糖的产率、聚合度和成键类型等都取决于β-半乳糖苷酶的性质[5]。目前,商业化合成低聚半乳糖的β-半乳糖苷酶主要来源于环状芽孢杆菌、米曲霉和乳酸克鲁维酵母等[5,20]。来源于环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的反应温度为40～60 ℃,pH接近6,产率为40%;米曲霉来源的β-半乳糖苷酶的最佳反应温度为40～60 ℃,最适pH为4.5,低聚半乳糖的产率接近30%,且相对于环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶而言在酶制备工艺上更为便捷;乳酸克鲁维酵母来源的β-半乳糖苷酶反应温度则为35～40 ℃,pH为6.5,低聚半乳糖产率为30%左右。此外,来源于乳酸克鲁维酵母的β-半乳糖苷酶其水解活性较强,更适宜于乳糖水解而非低聚半乳糖的合成[5]。

另据报道,不同来源的β-半乳糖苷酶蛋白三维立体结构和反应机制存在差异,对水和糖具有不同的选择性,反应条件不同,从而导致低聚半乳糖的产量和结构也会有所不同(即β-半乳糖苷酶的来源,决定了GOS的产量、产物组成和类型)[38]。如Huang等[29]将来源于产酸克雷伯氏菌[39-40]的两段β-半乳糖苷酶基因进行异源表达,并进行转糖基活性和水解活性考察,获得高活性β-半乳糖苷酶,该酶在反应温度为37 ℃,初始乳糖质量浓度为400 g/L,反应pH为7.5,加酶量为10 U/g乳糖,反应时间为48 h的条件下,低聚半乳糖产率为45%左右,产物质量浓度达到178 g/L(包括异乳糖、低聚半乳二糖、三糖和四糖)。朱五二等[41]以来源于盐单胞菌S62β-半乳糖苷酶为研究对象,在反应温度为40 ℃,初始乳糖质量浓度为300 g/L,反应pH为7.0,加酶量为50 U/mL,反应时间为6 h的条件下,低聚半乳糖产率为42%左右,产物包括异乳糖、半乳二糖、2种低聚半乳三糖及2种低聚半乳四糖。Rodriguez-colins等[42]利用来自乳酸克鲁维酵母的β-半乳糖苷酶,在初始乳糖质量浓度为400 g/L,反应pH 7.0,反应温度40 ℃,加酶量为1.2～1.5 U/mL,反应时间为6 h的条件下,低聚半乳糖最大产量为177 g/L,乳糖转化率为76%,产物包括双糖6-半乳二糖、异乳糖和6-半乳糖基-乳糖等。Urrutia等[43]利用来自米曲霉的β-半乳糖苷酶,在反应温度为40 ℃,初始乳糖质量浓度为400 g/L,反应pH为4.5,加酶量为15 U/mL,反应时间为7 h的条件下,GOS最大质量浓度为107 g/L(占糖总量的26.8%),相当于大约70%的乳糖转化率,产物包括半乳糖、3-O-β-半乳糖基葡萄糖和6′-O-β-半乳糖基-乳糖等。Yanahira等[44]利用来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶,在反应温度为60 ℃的条件下,将该酶(275 U)加入含有乳糖(55 g)的溶液(45 mL)中(pH为6.0),反应23 h,产物有11种低聚糖(包括3种二糖和8种三糖)分别为β-D-Galp-(1→3)-D-Glc,β-D-Galp-(1→6)-D-Glc,β-D-Galp-(1→2)-D-Glc,β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-D-Glc,β-D-Galp-(1→6)-[β-D-Galp-(1→2)]-D-Glc,β-D-Galp-(1→6)-[β-D-Galp-(1→4)]-D-Glc,β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→3)-D-Glc,β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→2)-D-Glc,β-D-Galp-(1→4)-[β-D-Galp-(1→2)]-D-Glc,β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→6)-D-Glc,β-D-Galp-(1→6)[β-D-Galp-(1→3)]-D-Glc。不同来源β-半乳糖苷酶进行GOS生物催化制备工艺的研究结果如表2所示。

表2 不同来源β-半乳糖苷酶生物催化制备GOS

除β-半乳糖苷酶自身的酶学性质外,催化条件初始乳糖浓度和反应温度也是生物催化法制备低聚半乳糖的关键因素。高于质量与体积比为30%的初始乳糖浓度有利于合成反应,即有益于提高低聚半乳糖产率[50]。然而,乳糖的溶解度较其他糖类弱,温度为30 ℃时溶解度仅为25%的水,40 ℃时也仅为33%的水,虽然可以通过过饱和的方式来获得高浓度的乳糖溶液,但过饱和溶液不稳定,乳糖容易析出,因此提高转化体系温度不仅可以获得更高的底物(乳糖)初始投料质量浓度,也有利于提高低聚半乳糖的合成效率。与此同时,过高的反应温度容易造成催化剂β-半乳糖苷酶的变性失活,通过筛选或分子定向进化获得耐高温β-半乳糖苷酶提高低聚半乳糖的合成效率(转化体系底物投料比、产物时空得率和产物纯度等),是酶法合成低聚半乳糖研究的又一热点问题。目前,国内外研究[8]发现来自硫磺矿硫化叶菌、激烈火球菌、栖热菌属细菌、嗜钙热单胞菌、解糖葡萄球菌和海栖热袍菌等超嗜热微生物的糖苷水解酶,具备在80 ℃或更高温度下催化转糖基反应的能力,有益于提高生物催化法制备低聚半乳糖的产率。

3 酶法合成的低聚半乳糖分离纯化

迄今为止,产率低仍是生物催化法制备低聚半乳糖工业化生产的短板,针对β-半乳糖苷酶介导的酶法合成路线,低聚半乳糖收率通常在20%～45%(对应于40%～60%的底物乳糖转化率),而通过生物催化剂或过程工程技术优化大幅提高低聚半乳糖产率的尝试还未见成功的案例,因此去除酶法合成路线最终转化液中未反应的乳糖和水解后未被聚合的单糖(葡萄糖和半乳糖)成为低聚半乳糖分离纯化研究的主要难点和瓶颈[32]。据报道,目前低聚半乳糖的纯化方法有色谱分离法、膜分离法、酶法和选择性发酵法等[51]。

色谱分离法是依据待分离物料各组分在固定相与流动相间结合力不同,被先后分离出来,其中最常用于分离糖类物质的是离子交换树脂[52]。李良玉等[53]研究人员用自制的模拟移动色谱和顺序式模拟移动色谱设备分别纯化了低聚半乳糖粗品,得到了较好的分离效果,通过对比分析,采用顺序式模拟移动色谱得到的效果更好,在进料折光60%,柱温60 ℃,进料量467 mL/h,进水量722.4 mL/h的实验条件下,低聚半乳糖收率为91.3%,质量分数为95.1%。Wisniewski等[54]报道利用模拟移动床(SMB)技术能够获得质量分数为99.9%的低聚半乳糖。膜分离法则是依据滤膜孔径不同,使得小分子物质通过孔径,而大分子物质被截流,从而将不同分子大小的组分分离,其中超滤及纳滤常被应用于功能性多聚糖的分离纯化[55]。Feng等[56]用截留相对分子质量Mw为800～1 000 Da的NF-3膜对低聚半乳糖粗产品进行纯化,其中单糖和乳糖的脱除率分别为90.5%,52.5%,低聚糖质量分数为54.5%(为粗产品的1.5倍),寡糖得率为70%。Goulas等[57]利用2种不对称的醋酸纤维素膜(NF-CA-50和UF-CA-1)将低聚半乳糖粗产品进行连续过滤透析后,低聚糖质量分数可达到98%。由于低聚半乳糖与污染物(主要是乳糖和单糖)之间的分子质量大小相近,因此通过膜分级分离是一项艰巨的任务。有效去除单糖虽然是一个合理的方法,但是去除乳糖将需要酶促预水解步骤,从而导致生产率降低和成本增加。膜分离法虽然选择性好、无污染和能耗低,但设备昂贵且需要经常清洗和维护,否则可能会造成膜污染,因此限制了该方法在大规模工业化生产中的应用。酶法是通过加入酶制剂选择性去除相应的单糖和乳糖。这种方法的酶具有专一性,纯化效果较好,产品纯度高的优点。Maischberger等[58]利用源自罗氏链球菌特异性较强的纤维二糖脱氢酶对低聚半乳糖粗产品进行纯化,而后结合色谱步骤去除离子和单糖,得到较为纯净的低聚半乳糖,单糖和乳糖质量分数低于0.3%,低聚半乳糖的收率达到60.3%。酶法纯化工艺因酶制剂稳定性差、回收率差和价格高等因素导致成本较高,且随着酶解反应的发生,反应体系的pH会逐渐降低,也会影响酶的活性,因此限制了其工业化应用。

除以上几种分离纯化方法,基于微生物选择性发酵特性的发酵分离方法也能有效提高低聚半乳糖的纯化效果,也是近期国内外研究的热点问题。例如,使用克鲁维酵母和啤酒酵母菌株,通过酵母发酵(生物转化)从原始低聚半乳糖的转化液中选择性去除可代谢的糖类(葡萄糖、半乳糖和乳糖),从而实现低聚半乳糖纯化的目的。Rengarajan等[59]对酿酒酵母(S.cerevisiae)选择性发酵连续生产高纯度异麦芽低聚糖(IMOS)进行了研究,将低质量分数IMOS(67%)与分离菌株酿酒酵母(4%)在3 L生物反应器中孵育1 h,结合微滤膜循环获得高质量分数IMOS,产物质量分数>91%,收率79%,最高时空产率为198.79 g/(L·h)。Yoon等[60]利用酿酒酵母对低聚半乳糖转化母液进行了选择性发酵特性的研究,研究发现:厌氧糖酵解24 h可以特异性地去除低聚半乳糖转化母液中单糖(葡萄糖和半乳糖)质量浓度,提高产品质量分数。此类选择性发酵分离方法虽可获得高质量分数的产物,但选择性发酵(生物转化)也有其缺点,发酵过程需要较高的菌体量,且需要对未纯化的低聚半乳糖进行稀释,而代谢副产物如乙醇、乙酸和甘油等的产生亦会影响产品的质量分数和产量[5]。

4 低聚半乳糖工业化生产现状

低聚半乳糖的工业化起源于日本[4],随后欧洲和美国也相继开始了低聚半乳糖的商业化生产,我国的低聚半乳糖工业则起步较晚。现如今,已有国内外多个公司将目光瞄准了低聚半乳糖产业,进行低聚半乳糖商业化生产的厂家主要有日本养乐多株式会社、日本日新糖制造有限公司、荷兰兹沃尔弗里斯兰有限公司、美国伊利诺伊州玉米制品国际公司、中国保龄宝生物以及量子高科生物股份有限公司等[23],市场上主要的低聚半乳糖产品如表3所示。国内外低聚半乳糖工业化生产虽然已经取得了长足进步,但低聚半乳糖工业仍然存在一些亟待解决的问题,如低聚半乳糖分离纯化困难(目前,国内市场大多数国产低聚半乳糖产品的质量分数低于57%),以及现有的商品化β-半乳糖苷酶活性不高(GOS产率约为30%～40%)。因此,开发高效的低聚半乳糖分离纯化方法和寻找新的性能优良的β-半乳糖苷酶将是未来低聚半乳糖工业化研究的主要方向,具有较高的研究价值和发展前景[61]。

表3 部分商品化GOS产品信息汇总

5 结 论

通过上述分析,低聚半乳糖因其出色的理化性质和优良的生理功效已广泛应用于婴幼儿配方奶粉、发酵乳、糖果产品、烘焙食品、家畜饲料和宠物食品等产业,具有持久的发展潜力。伴随生物催化法制备低聚半乳糖研究的不断深入,国内外学者在生物催化制备低聚半乳糖的工具酶源开发、催化制备工艺开发和低聚半乳糖的分离纯化方法研发等方面进行了诸多尝试,且取得了不小的进步,但研究成果仍然不能较好地满足工业化生产需要及日益扩大的市场需求。目前,从生产工艺上来看,低聚半乳糖产率不高、分离纯化困难仍是制约低聚半乳糖工业发展的重要因素。除此之外,我国低聚半乳糖生产工业还存在诸如催化剂来源单一、产品纯度低和检测手段匮乏等问题需要加以改进。相信随着国内研究人员在以上研究方向上不断努力,突破生物催化法制备低聚半乳糖的难点和瓶颈问题,将逐渐补足技术发展中的短板,实现低聚半乳糖的生物催化法高效制备,使低聚半乳糖作为益生元逐渐深入国人的日常生活,服务于我国大健康产业,产生相应的经济效益和社会效应。