基因工程技术生产重组胶原蛋白的研究进展

魏 春,刘 春,刘心雨,张旭初,王 欢

(1.浙江工业大学 生物工程学院,浙江 杭州 310014;2.杭州纽龙日尚生物制品有限公司,浙江 杭州 310000)

胶原蛋白是一种生物高分子,它广泛存在于动物结缔组织中,约占体内蛋白总量的25%～30%,是哺乳动物体内分布最广、质量分数最多的功能性蛋白。由于其良好的生物活性、生物相容性以及生物降解性,它在生物医学、食品和化妆品等领域都有着广泛的应用[1]。

胶原蛋白具有很强的稳定性,是当下生物医学、药剂学、工业化学及材料学等研究的热点之一。人源胶原蛋白的种类多且结构复杂,据统计,已经发现并且得到确认的共有30种以上的胶原蛋白,其中占比较多、研究较为透彻的是Ⅰ型、Ⅱ型以及Ⅲ型胶原蛋白[2]。从动物组织提取胶原蛋白成分虽然已有很长历史,但是工艺复杂且单体分离较难,还可能携带病毒存在安全隐患,其产量较低不能满足人们对胶原蛋白的巨大需求。相比之下,利用基因工程技术生产胶原蛋白具有提取法不具备的优点,产品稳定性及安全性高。因此,该技术近年来发展迅速,已经成功地进行了商化业开发与生产,各类相关研究也日趋深入。

1 胶原蛋白的结构

胶原蛋白由原胶原组成,每个原胶原都有一种特殊的三重螺旋结构,由3条α-螺旋的肽链缠绕而成,长度约为1 000个氨基酸残基;每条α肽链通过左手螺旋缠绕,3条肽链一起形成一个大的右手螺旋结构(图1)。胶原特有的左旋α链相互缠绕构成胶原的右手复合螺旋结构,这一区段称为螺旋区段,区段最大特征是氨基酸呈现(Gly-X-Y)n周期性排列,其中X,Y位置为脯氨酸(Pro)和羟脯氨酸(Hyp)的比例很高,约占25%,是各种蛋白质中含量最高的;胶原蛋白中存在的羟基赖氨酸(Hyl)在其他蛋白质中不存在。羟脯氨酸(Hyp)不是以现成的形式参与胶原的生物合成,而是从已经合成的胶原肽链中的脯氨酸经羟化酶作用转化来的。

图1 胶原蛋白的三链螺旋结构

2 重组鼠胶原蛋白

1997年,Fukuda等[3]成功地将鼠IV型胶原α1链全克隆并转染到CHO细胞株进行表达,但所得胶原蛋白以单链状态居多,只有极少的三螺旋结构,大多数单链交联成不规则的高级结构。1999年,Werten等[4]在毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统中成功分泌表达了大鼠Ⅰ,Ⅲ型胶原蛋白基因片段,分子质量约为2.1×104Da的片段表达量高达14.8 g/L,但是没有三螺旋结构,也没有发生羟基化。2002年,Bruin等[5]将一段分子质量约2.8×104Da的鼠Ⅰ型胶原α1链的螺旋结构区域克隆并转化到多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)NCYC495中进行表达,由于酵母自身可以合成脯氨酸羟化酶(Prolyl 4-hydroxylase,P4H),对表达的胶原蛋白虽然具有一定的羟基化修饰能力,但是与天然胶原蛋白相比,羟基化并不充分,仅约65%。

3 重组人胶原蛋白

为了避免动物来源产品所带来的高风险和不确定性,以及能充分利用胶原蛋白和明胶的优良特性,许多研究人员利用基因工程的技术,选用各种宿主细胞,如转基因植物、转基因动物、昆虫细胞、细菌和酵母等生产重组人胶原蛋白和明胶,其产品安全性好、质量稳定,消除了传统提取方法存在的病毒隐患,同时也改善了胶原蛋白和明胶的亲水性及免疫排异性等问题。

3.1 动、植物表达重组人胶原蛋白

Toman等[6]报道了将胶原蛋白基因片段和αS1-乳腺酪蛋白特异性启动子基因片段转化小鼠,通过转基因鼠的分泌型乳腺生产全长的人I型原胶原(Procollagen)。鼠乳中三螺旋结构的可溶性同型三聚体质量浓度达到8 mg/mL。该产量虽然较高,但是氨基酸分析显示其中的羟脯氨酸质量分数只有正常水平的40%～45%。推测乳腺上皮细胞中P4H的水平是其羟基化的主要限速步骤,如果转入编码P4H的基因就可以大大降低这种限制。理论上共转化胶原蛋白和P4H对应基因的动物能够产生大量的作为重组胶原来源的乳汁,其中存在的安全隐患依旧没有消除。

Tomita等[7]构建了载体并采用基因植入的方法,通过转基因蚕的丝腺分泌表达人Ⅲ型胶原蛋白片段,其分泌的人Ⅲ型胶原蛋白片段的长度仅为人胶原蛋白全长的1/5,重组胶原蛋白质量分数也仅占蚕茧干质量的1%,且转基因蚕丝腺中P4H活力偏低导致脯氨酸不能被充分羟基化。对此,日本广岛大学的Adachi等[8]采用多基因共表达技术实现胶原蛋白和高活力的P4H的共表达,结果显示转基因蚕的P4H活力是野生型的130倍,从而解决了脯氨酸不能充分羟基化的问题。2010年,该研究机构利用转基因蚕的中部丝腺分泌表达了人Ⅰ型胶原蛋白α1链,并通过导入杆状病毒反式激活子IE1基因和培育纯合子转基因蚕,其表达量提高到了蚕茧干质量的8%[9]。由于目的蛋白分泌到蚕丝中亲水的丝胶层,提取、纯化虽然较为简单,但仍因为转基因蚕丝腺中P4H活力较低,造成所表达出的人Ⅰ型胶原蛋白α1链缺乏羟脯氨酸,不能形成三螺旋结构。

Merle等[10]通过共转化人Ⅰ型胶原蛋白基因和嵌合的P4H对应基因至烟草植株,成功表达了羟基化的同型三聚体重组胶原蛋白。这是第一次运用瞬时表达技术,在烟草中共表达动物细胞来源的修饰酶,从而提高了植物中重组蛋白的质量。Eskelin等[11]以大麦种子作为宿主,成功表达了人Ⅰ型胶原蛋白的全长α1链。研究者同时也在尝试利用昆虫细胞表达人胶原蛋白。Nokelainen等[12]构建了两株杆状病毒表达系统,其中一株编码人Ⅲ型原胶原α1链,另一株编码人P4H的α和β亚基,通过共感染昆虫细胞,成功表达了人胶原蛋白,并具有稳定三螺旋结构,表达量达50 mg/L。

由于动、植物细胞的培养难度大,成本高,想要大规模生产不太理想。因此,采用微生物作为宿主仍然是较为理想的选择。

3.2 微生物表达重组人胶原蛋白

3.2.1 国外研究人胶原蛋白进展

1997年,Vuorela等[13]成功利用毕赤酵母表达了人Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ型胶原蛋白全序列。大量研究表明胶原蛋白与关键酶P4H在宿主细胞的共表达是一个较好的策略。与胶原蛋白共表达,不仅促进了宿主表达的P4H的亚基正确且高水平地组装成具有活性的四聚体,同时也使得胶原蛋白能够被P4H充分羟基化。研究表明:与胶原蛋白的共表达还能显著提高P4H的半衰期,例如与Ⅲ型胶原蛋白共表达,其半衰期可显著提高15倍;酵母共表达P4H得到的胶原蛋白能折叠成正确的空间结构,并能充分地被羟基化,并且表达量可达0.2～0.6 g/L,但是不能够分泌表达出细胞,只能积累在细胞的内质网内腔。即使进一步尝试使用α-MF信号肽也只能够极少量地提高其分泌量,同时又会减少Ⅰ型胶原蛋白的表达总量。通过分析产物,得到各重组蛋白的4-羟脯氨酸质量分数与天然胶原蛋白一样,并且能在体外正确组装成胶原纤维。继续对Ⅰ型胶原蛋白进行研究,将肽链的N末端基因切除,利用先前的方法构建重组酵母。结果表明:重组酵母表达得到的胶原分子其结构、性质等都接近于天然的胶原蛋白,同样也能在体外组装成胶原纤维,仅四基因的单拷贝重组子的胶原蛋白表达量就高达0.5 g/L,比在同样条件下表达Ⅰ型胶原蛋白提高了1.5～3倍。

Werten等[14]利用重叠延伸PCR法获得了约300 bp基因序列的高度亲水的重组明胶,并在pPIC9K载体中重复连入目的基因形成4段重复,转化到毕赤酵母中表达,单拷贝转化子能产重组明胶3～6 g/L。Olsen等[15]研发了小分子质量的重组人源性明胶,其长度仅为101个氨基酸,并利用毕赤酵母X-33进行表达,经过高拷贝的筛选后发酵制备了具有生物活性的人源性明胶,产量达到1.47 g/L,经纯化后替代动物来源的胶原蛋白用作疫苗稳定剂。Pakkanen等[16]利用毕赤酵母选择性地分泌表达缺失C端肽的单链重组胶原蛋白片段(分子质量为9×103～4.5×104Da),具有C端肽的胶原蛋白片段虽然可以形成三螺旋结构,但不能分泌表达。这从一定程度上表明胶原蛋白的分泌表达与其分子质量大小、三螺旋构象以及C端肽等因素有关。

3.2.2 国内研究人胶原蛋白进展

范代娣等[17]采用PCR技术获得人胶原蛋白基因片段,进行拼接重组后转化大肠杆菌,通过高密度发酵方式培养生产类人胶原蛋白,其表达量达到29.4%,并进行了发酵条件和纯化等多方面的研究。为了获得不含N和C末端肽的单链全长人胶原α1(Ⅲ)链(COL3A1)的高水平分泌表达,研究人员将人COL3A1对应基因的cDNA克隆到毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K中,并整合到毕赤酵母GS115中[18]。SDS-PAGE和蛋白质印迹分析表明:未水解的重组人COL3A1(rhCOL3A1)被分泌到培养基中,并显示出约130 kDa的表观分子质量,这比理论值高1.4倍。最后,使用四步方法将未羟基化的rhCOL3A1纯化至高于90%的纯度。此外,甲基噻唑基二苯基四氮唑溴化物实验表明低浓度的rhCOL3A1能有效促进幼仓鼠肾细胞(BHK21)增殖。

高立虎等[19]基于人Ⅲ型胶原α1链胶原域Gly-X-Y的三肽重复序列特征,以改善胶原蛋白水溶性和提高表达量为目的,设计并合成了一段编码具高亲水性的Gly-X-Y三肽重复序列人源胶原蛋白的基因单体,再通过同向串联构建高重复序列人源胶原蛋白表达载体,最终转化毕赤酵母,实现了重组人胶原蛋白的分泌表达,所表达的重组人胶原蛋白展现出良好的生物医学应用前景。其优点在于:完全人工合成,在保持天然胶原蛋白胶原域Gly-X-Y序列的高度重复前提下,可以更加灵活地改变人胶原蛋白氨基酸序列;通过改变酸性氨基酸和碱性氨基酸的比例,调节人胶原蛋白的等电点;编码各种氨基酸的密码子可以完全替换为毕赤酵母的偏好密码子;单体的串联策略允许构建成不同重复数的类人胶原蛋白基因;分泌表达有利于表达产物的分离纯化,降低成本;在毕赤酵母表达系统中,所表达的外源蛋白有一定的翻译后修饰功能,如糖基化、脂肪酰化和磷酸化等;生产周期短[20]。

张自强等[21]研究了采用酶解、透析、冻干和灭菌等工艺所制备的去端肽Ⅰ型胶原蛋白,质量分数可达99.8%,DNA残留量为4 μg/g,远低于50～100 μg/g,C,N末端肽浓度低于试剂盒检测限度,即未检出Ⅰ型胶原C和N末端肽,α-Gal抗原质量分数低于检测限度。说明在去端肽Ⅰ型胶原蛋白的制备过程中,酶解工艺对Ⅰ型胶原蛋白的端肽去除效果非常显著,极大地降低了Ⅰ型胶原蛋白的免疫原性。

He等[22]研究表明:适当羟基化的人Ⅲ型胶原蛋白α1链可以在毕赤酵母GS115中产生,其没有N端前肽和C端前肽,也不能形成三螺旋结构。通过共表达重组人脯氨酰4-羟化酶(P4H),成功地产生了含有羟脯氨酸残基的人Ⅲ型胶原蛋白α1链。结果证实:羟脯氨酸残基仅在Ⅲ型胶原蛋白α1基因与P4H的基因共表达时出现。液相色谱-质谱/质谱分析能够测量不同样品中特定氨基酸位置的羟基化脯氨酸。

由于对外用胶原蛋白能否被人体皮肤直接吸收利用的问题尚存争议,如果不能被皮肤直接吸收,则意味着外用胶原蛋白的作用将大打折扣。因此,马淑骅等[23]研究了重组人源胶原蛋白对小鼠皮肤激光损伤的修复作用,探究了其作用机制。在前期研究中应用二次谐波(Second harmonic generation,SHG)成像结合双光子荧光成像[24]的方法观察了重组人源胶原蛋白的透皮吸收情况,发现重组人源胶原蛋白可以沿着毛囊进入真皮层,并从毛囊中扩散至胶原纤维层从而补充皮肤中的胶原纤维。研究人员应用458～514 nm激光照射小鼠背部皮肤制作皮肤损伤模型,将重组人源胶原蛋白外涂于创伤皮肤,剂量为8 mg/mL(生理盐水配制),每天涂抹1次,连续给药14 d。分别于给药后1,4,7,14 d用双光子显微镜收集二次谐波信号检测伤口真皮中的胶原纤维,并进行常规HE染色,观察伤口局部的病理学改变。体外试验检测重组人源胶原蛋白对人皮肤角质形成细胞和成纤维细胞增殖活力的影响,计算细胞存活率。在小鼠模型上显示,与对照组相比,重组人源胶原蛋白可明显加速伤口的愈合,缩短伤口愈合时间;SHG显示重组人源胶原蛋白能够促进创伤局部胶原的产生;体外试验也显示它有促进人皮肤成纤维细胞和角质形成细胞增殖的能力。由此可见:重组人源胶原蛋白(8 mg/mL)对小鼠激光损伤皮肤有修复作用,可能是通过促进表皮角质细胞和真皮成纤维细胞的增殖,促进胶原的沉积而发挥修复作用的。

唐云平等[25]通过在大肠杆菌中将类人胶原蛋白基因与人脯氨酰-4-羟化酶(P4H)和D-阿拉伯-1,4-内酯氧化酶(ALO)共表达,构建了一个原核表达系统来生产羟基化类人胶原蛋白,并且研究了5种不同的培养基以及诱导条件对该蛋白可溶性表达的影响。结果表明:当重组细胞在MBL培养基中生长并在指数生长期中期由0.1 mmol/L IPTG诱导时,摇瓶获得的目标类人胶原蛋白的最高可溶性表达水平为(49.55±0.36)mg/L。采用葡萄糖补料策略,在10 L的台式发酵罐中,目标类人胶原蛋白的表达水平可提高到260 mg/L。此外,高效液相色谱分析显示:在纯化的类人胶原蛋白中,超过10%的脯氨酸残基被成功羟基化。

4 结 论

胶原蛋白由于其良好的生物相容性、降解性及其他生物活性,越来越受到人们的关注,通过基因工程生产胶原蛋白的方法也由于其安全性高、产量高和成本低等优势,逐渐成为研究热点。国内外胶原蛋白的需求量正稳步增长,尤其是高质量的胶原蛋白,其产品市场前景广阔。因此,有关基因工程技术生产重组胶原蛋白的研究也在不断向前推进。利用重组技术生产胶原蛋白虽然已经取得了长足的进步,但是目前制备的重组胶原蛋白的产量、结构特性及纯度仍有提升空间。

本文得到了杭州纽龙日尚生物制品有限公司、会稽山绍兴酒股份有限公司及绍兴黄酒学院的资助。