药用微生物育种技术及其应用进展

吕孙燕,汪 祎,陈金芸,王 鸿,章华伟

(浙江工业大学 药学院,浙江 杭州 310014)

微生物次级代谢产物具有丰富的结构多样性和显著的生物活性。据统计,微生物来源的活性天然产物已达22 500种,其中45%来源于放线菌,38%来源于真菌,17%由小单胞菌产生,且微生物先导化合物已占据了临床用药50%以上[1]。然而,野生型菌株先导物的产量低、成分复杂,后期制备分离成本高,往往导致其无法产业化应用。诱变育种是一种利用物理、化学和生物等因素使机体的遗传物质发生改变的技术,可以提高先导药物的产量和质量,并诱导其产生结构新颖的化合物。由于突变率高、操作方便和突变周期短等优点,诱变育种技术已被广泛应用于菌种改造[2]。常见的诱变育种方式有物理诱变、化学诱变、生物诱变和复合诱变。笔者通过大量文献查阅和梳理,系统介绍4种诱变育种方式中的各种诱变育种的技术原理及其在成功应用案例,并为不同菌株的诱变剂的选择提供参考。

1 物理诱变

辐照诱变是传统物理诱变中运用较多的技术,主要通过各类射线对微生物菌株进行辐照,包括紫外线(UV)、X射线、γ射线和中子等。近年来,微波诱变、热诱变、离子束诱变和大气室温等离子体(ARTP)诱变等新型物理诱变技术也得到了广泛应用。

1.1 传统物理诱变技术

1.1.1 紫外(UV)诱变

紫外对于微生物的作用机制有很多个解释,其中研究的比较清楚的一个作用机制是紫外线能使DNA分子形成嘧啶二聚体,即2个相邻的嘧啶通过共价键连接[3]。这种嘧啶二聚体的出现不但会减弱双键之间氢键的作用,引起DNA双链结构扭曲变形,阻碍碱基的配对,从而引发突变或死亡,而且会妨碍DNA双链的解开,影响DNA正常的复制和转录而引起突变[4]。朱相成等[5]以产6-脱氧博来霉素的链霉菌株SB9026作为出发菌株,在紫外波长为254 nm的条件下照射6 min,得到了较高产菌株,效价达(26.0±1.8)mg/L,比原始菌株的初始滴度提高了30%。张健[6]对青霉素产生菌青霉菌(Penicilliumsp.)进行紫外诱变后,青霉素摇瓶产量比原始菌株高20%左右,灰黄霉素摇瓶产量比原始菌株高10%左右,并且经过10代遗传后产青霉素的产量基本稳定。Feng等[7]从霉变的果实中分离出一株米曲菌(Aspergillusoryzae),并能产生次级代谢产物曲酸,以此菌株作为起始菌株KA-11,距紫外灯40 cm处照射30 min后,通过筛选后得到高产菌株UV-22,比原始菌株曲酸的产量提高了87.1%,其中正突变率为61.2%。

1.1.2 激光法诱变

激光诱变技术作用于生物体已经有30多年的历史,激光的热、压力、光和电磁场的效应能够引起生物体的反应,即酶失活、蛋白质变性、组织变形、破裂、DNA损伤和生物分子变异。低功率的激光(波长440～700 nm)器有YAG,He-Cd,Ar+,Ar+,DCM脉冲染料和He-Ne等[8]。朱自平等[9]对药用真菌桑木耳(Phellinusigniarius)用He-Ne激光在功率为40 mW的He-Ne激光下进行40 min的诱变后,进行遗传稳定性筛选,鉴定出一个漆酶活性高的菌株SJZ2,比原始菌株漆酶活性提高36.84%。黄铭杰等[10]以UV-LiCl复合诱变后的突变株GM120-43为出发菌株,用半导体激光在功率15 W对其进行照射120 s,获得高产灰黄霉素突变株C1448-1,再使用CO2激光在功率密度(1 448 mW/cm2)诱变后得到一株高产突变株C1448-1,灰黄霉素的效价提高120.69%。刘建龙等[11]对一株产L-缬氨酸的黄色短杆菌(BrevibacteriumflavumBFS)进行He-Ne激光诱变育种,实验通过设置不同的诱变强度和时间,确定在照射功率15 mW、时间为20 min时,得到一株可以稳定遗传至少10代的突变株,产量对比原始菌株提高25.5%。

1.1.3 γ射线诱变

γ射线诱变的作用机制是利用放射源放射出的快速运动的带电粒子作用于机体,使机体的内部物质发生电离或激发,形成正离子和负离子或激发态原子。这些原子或离子与周围大分子核酸和蛋白质发生反应,使遗传物质结构发生改变,从而产生新物种[12]。白豆等[13]对产1-脱氧野尻霉素(DNJ)的枯草芽孢杆菌黑色变种(Bacillussubtilisvar.niger)进行60Co-γ射线诱变,在诱变剂量为800 Gy条件下筛选到得到发酵液中DNJ表达量达到20.7 mg/L的高产菌株,比初始菌株提高了27.7%,可缓解目前DNJ在天然产物中质量分数低、分离提取过程中流失大的问题。王军等[14]以黑曲霉(Aspergillusniger)Co827为出发菌株,采用高剂量60Co-γ射线辐照,并复合N+离子注入的方法筛选到菌株CN05,产柠檬酸比出发菌株提高18.44%。Lazim等[15]以土霉素产生菌链霉菌CN08为出发菌株,用高剂量(2～4 kGy)60Co-γ射线辐照15～30 min后结合卡那霉素抗性筛选得到高产菌株,比原始菌株土霉素产量提高19倍,为土霉素的生产提供便利。

1.2 新型物理诱变技术

1.2.1 微波诱变

自18世纪以来,科学家对不同频率的电磁辐射与生物体生命活动的相互作用感兴趣,微波的辐射频率是其中的重要组成部分[16]。微波的频率为300 MHz～300 GHz,目前最常用的频率为2 450 MHz。微波作用于微生物的生物效应可分为热效应和非热效应。热效应是指一定频率和波长的微波作用于生物体后引起生物体的局部温度升高,导致机体出现一些生化反应的效应;非热效应是指一定频率和波长的微波作用于生物体后不引起生物体的局部温度升高,能够引起生物体强烈的生理生化反应的效应。微波辐射通过热效应和非热效应使生物体产生突变,目前普遍认为非热效应是微波辐射产生突变的主要来源[17]。倪赛等[18]以具有广谱抗菌活性的抗生素桔青霉产生菌(Penicilliumsp.)PA-33作为出发菌株,在诱变条件为微波炉功率700 W,频率22 kHz,低火处理30 s后得到一株突变体WB-6,活性提高32.29%,正向突变率为61.54%,在实验中还发现微波单因子诱变的正向突变率高于微波-超声波-3% DES复合诱变。刘鹏等[19]以弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae)BL-16菌株为出发菌株,泰乐菌素初始发酵效价6 526 mg/L。在微波功率为750 W,脉冲频率为2 500 MHz对孢子悬液进行微波诱变60 s后得到8株正向突变的突变体,其中摇瓶效价最高达到9 525 mg/L,对比于出发菌株效价提高了45.95%。

1.2.2 热 诱 变

热诱变是一种通过温度改变来实现对微生物诱变的手段,至今对热诱变的作用机制并不明确,但是有研究表明热处理可以引起碱基对G-C→C-G的颠换,从而引起微生物的遗传物质发生改变[20]。李瑾等[21]以炭样小单孢菌(Micromonosporacarbon-acea)JXNU-1作为出发菌株,在76 ℃恒温水浴中处理10 min后,发酵后发现质量抗生素浓度比原始菌株提高98.53%。

1.2.3 重离子束诱变

我国科学家自1986年发现重离子注入对水稻的生物学效应,开始用离子束法来改良生物的性状。现如今重离子注入作为一种新的基因改造手段,在农作物和工业微生物育种中作出了巨大贡献。通过重离子束诱变能使微生物的遗传信息发生改变,从而获得理想的工业菌[22]。缪建顺等[23]对谷氨酸棒杆菌12C6+离子束辐照诱变谷氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum),经80MeV/u碳离子束辐照后得到了1株高产菌株GM006,其发酵最高产酸达121.1 g/L,比出发菌株提高了10.09%,该突变菌株GM006是有医学前景谷氨酸工业菌株。Wang等[24]对阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)采用重离子诱变的方法选育阿维菌素B1A高产突变株,在12C6+重离子辐照阿维链霉菌孢子70 Gy后获得的突变体ZJAV-Y-147和ZJAV-Y-HS,阿维菌素的产量分别为4 822.23,4 632.17 mg/L,是原始菌株阿维霉素产量的2倍以上。李悦明等[25]对产二十碳五烯酸(EPA)的微拟球藻(Nannochloropsis)进行了重离子辐照,在联合三氯生诱变的条件下得到了突变株M44,其EPA质量分数为43.3%,是出发藻株的2.38倍。

1.2.4 ARTP诱变

ARTP技术是指能够在大气压下产生具有高活性粒子(包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子和OH自由基等)、温度在25～40 ℃等离子体射流,可直接改变DNA的分子结构,造成DNA损伤,引起DNA颠换、转换和缺失等[26-27]。张奎普等[28]以盐霉素产生菌白色链霉菌(StreptomycesalbusS12)为出发菌株,在ARTP源功率100 W、气流功率10 L/min、发射源和之间的距离载体直径2.5 mm,等离子体温度28 ℃条件下诱变360 s,结合核糖体工程后盐霉素产量是原始菌株的2倍以上。鲍海燕[29]对爪曲霉(Aspergillusunguis)DLEP2008001进行等离子诱变后得到突变菌株6-20-6并进行了10 L的规模发酵,经过提取分离后得到6个化合物,均为缩酚酸环醚类化合物,且具有中等的抗菌活性。表明等离子诱变技术可以刺激菌株产生更多具有新颖结构的次级代谢产物,作为药物研发的先导化合物。祝金山等[30]对产核黄素的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)QJVB-1进行ARTP诱变处理,在注入气体为氦气,电源功率200 W,气流量10 L/min,照射距离2 mm,样品量10 μL,处理时间为140 s的条件下得到一株核黄素产量高、遗传性状稳定的突变株QJVB-2-91,该突变株核黄素最高产量达到9 447 mg/L,较出发菌株提高16.8%,发酵周期缩短6 h。与传统的诱变方法相比,ARTP技术能够对遗传物质造成多样性损伤,且易获得遗传稳定性良好的突变株。

综上所述,传统的物理诱变育种技术由于其设备简单、操作方便和等因素被广泛运用于诱变育种中,然而传统的物理诱变技术由于突变的随机性导致正突变率较低,且突变方向难以掌握,筛选工作量大,所以有一定的局限性。新型物理诱变技术的出现,如离子辐照、微波诱变和大气等离子体辐射等,为工业微生物育种工作开辟了新的方向。物理诱变技术能够在较短时间内获得优质的突变株,创造出新的基因类型,为基因工程改造工业化菌株提供广阔前景。

2 化学诱变

微生物的化学诱变育种是采用化学试剂作为诱变剂处理微生物体,来诱发遗传物质发生突变,在对突变体进行筛选、育种后得到高产突变体的诱变方法。

2.1 碱基类似物诱变

碱基类似物是与DNA中的嘌呤类和嘧啶类碱基相似的化合物,能在DNA复制和转录的时候代替正常的碱基进行互补配对而产生突变。

2.2 烷化剂诱变

亚硝基胍(NTG)是一种使用广泛、有效的烷化剂,也有超级诱变剂之称,可以引起多位点的突变。NTG极易取代DNA分子中的氢原子,使DNA分子上的碱基和磷酸被烷基化,从而引起DNA复制时的碱基对配对错误。常用的烷化剂有亚硝基胍(NTG)、乙基硫酸甲烷(EMS)、硫酸二乙酯(DES)和乙烯亚胺等。熊志等[31]用NTG法对普伐他汀产生菌马杜拉放线菌(Actinomadurasp.)进行化学诱变处理,在NTG最佳诱变剂量0.4 mg/mL处理30 min后,经过筛选得到一株P-N87的突变株,普伐他汀的产量比初始菌株高47%。韩鹏杰等[32]以海绵共生真菌(Emericellavariecolor)XSA-07-2为出发菌株,在DES质量分数1%下诱变24 h,得到阳性突变株M8,激活了菌株的沉默基因,得到了3个新颖的聚酮类化合物。

2.3 移码诱变剂诱变

移码诱变剂的作用机制是与DNA相互结合引起碱基缺失或增添而引起突变。它们主要包括ICR-191、吖啶黄、ICR-171和吖啶橙等。王世梅等[33]对阿扎霉素B产生菌(Strepto-myceshygroscopicus)吸水链霉菌NND-52菌株进行诱变处理,发现用吖啶橙处理菌株效果特别好,吖啶橙处理剂量大于5 mg/L时致死率超过80%,故以吖啶橙的质量浓度3 mg/L作为诱变处理剂量,得到了一株产量达到1 100 mg/L,比出发菌株提高3倍以上的稳定突变株。

综上所述,化学诱变法的优点是只需要简单的设备和少量的药剂,是一种较为简便的育种技术。化学诱变的机制与辐射诱变有很大不同,辐射诱变染色体突变范围广,而化学诱变是作用于基因的点突变,更便于研究生物合成机制。化学突变中有许多突变试剂(如一些烷化剂NTG和EMS),大多数是致癌试剂或者剧毒性,这为化学诱变带来了很大的局限性,因为反复使用单一化学诱变剂会使突变率降低,突变谱变窄,所以化学诱变一般与其他诱变手段进行复合诱变,诱变效果如表1所示。

表1 不同菌株选择不同诱变剂的诱变效果

3 生物诱变法

生物诱变法是指特定的寡核苷酸在突变技术中起着介导作用,使基因成为一种新的分子水平的生物诱变剂。基因诱变剂可以是特定的噬菌体和DNA转座子,可以引起DNA的缺失、重复和插入等突变。生物诱变随着蛋白质工程的发展在诱变体系中占据越来越重要的地位,生物诱变根据是否对特定的基因位点产生作用可分为非定点诱变和定点诱变。

3.1 非定点突变

3.1.1 基因组重排技术

基因组重排技术是一种能够有效构建高产菌株的育种技术如图1所示。在此过程中,通过紫外、ARTP和微波等技术诱变后筛选得到改良菌株,再通过原生质体同源重组融合,选择改良后代进行下一轮重组,多轮重复后以期获得高产菌株[34]。目前,对大多数微生物的次级代谢产物的生物合成机制不了解,因为基因组重排技术是建立在细胞内整套基因组中,所以不需要了解微生物的生物合成机制,就可以对次级代谢产物基因组背景不明确的微生物进行遗传育种。研究表明:该技术筛选高产菌株的时间远远少于传统的诱变育种技术,节约了人力资源,方便运用到工业微生物的育种工作中。徐波等[35]对替考游动放线菌吉安变种(Actinoplanesteichomyceticusvar.jianensis)SIIA01-11-25菌株进行了基因重组研究,以期望能提高其次级代谢产物药用替考拉宁的产量。首先对菌株进行了(UV+NTG)复合诱变处理后得到4株亲本菌株,再将其进行3轮基因组重排后筛选到SⅡA05-3-136的高产菌株,其次级代谢产物替考拉宁产量从原始株的1 825 mg/L增长到3 016 mg/L,效价提高了65.3%。用传统的诱变育种技术要达到此目标,通常耗时3～4年,而用基因重排技术仅耗时1年,大幅度减少了工作量和工作时间,提高了育种的效率。

图1 基因组重排技术原理示意图

3.1.2 核糖体工程

Ochi等[36]研究发现:核糖体能够在转录和翻译的过程中调节相关基因的表达从而调控微生物的次级代谢,使微生物产生次级代谢产物的产量发生明显改变。核糖体是合成蛋白质的器官,在微生物的稳定生长期时,与次级代谢产物的生物合成相关的基因表达大量取决于此时的核糖体功能。微生物的核糖体在经过修饰突变后能够直接或间接影响微生物次级代谢产物的产量,或激活微生物体内的沉默基因簇使其产生新的生物活性的物质。这一系列过程被称为“核糖体工程”(图2),是一种微生物育种的新方法。核糖体工程中常用与抗性筛选的抗生素主要有链霉素(Str)、林肯霉素(Lin)、遗传霉素(Gnt)、利福平(Rif)和庆大霉素(Gen)等。Zhang等[37]对深海来源的索马里链霉菌SCSIO ZH66进行核糖体工程,以激活隐藏基因簇的表达。由此用300 mg/L利福平获得了抗性菌株ZH66-RIF1,其在MS平板上积累了具有细胞毒性的褐色色素,而在野生型菌株中不存在。经过发酵条件的筛选,该色素化合物被纯化并鉴定为抗癌药物先导物弗雷德霉素(FDM)A,表明菌株ZH66-RIF1通过核糖体工程后发生了一个隐蔽的FDM A生物合成基因簇的激活。Zhuang等[38]通过链霉素诱导的方法对链霉菌(Streptomycessp.)CB03234进行诱变,在20 mg/L的链霉素诱导下得到了突变体S-60-16的,产物天赐米星(Tiancimycin-A)产量从0.3 mg/L提高到(13.7±0.3)mg/L,产物天赐米星(Tiancimycin-D)产量则由原来的微量显著增加到(19.2±0.4)mg/L,两者总体效价提高了109倍之多。李芹等[39]以高产ε-聚赖氨酸高产菌株(S.albulus)M-Z18为出发菌株,对其首先进行低浓度链霉素(1-5MIC)抗性菌株筛选,将M-Z18的ε-PL的摇瓶产量从1.6 g/L提高到2.43 g/L;随后进行高浓度链霉素(5-10MIC)筛选,获得一株高产突变菌SS-19,其ε-PL产量为3.13 g/L,较出发菌株提高了95.36%。

图2 核糖体工程激活细胞功能示意图

3.2 定点突变

自1982年Zoller和Smith的寡核昔酸诱导的定点突变方法发表后,以此方法为基础进行改进的方法如雨后春笋般产生,这些定点突变方法虽然使突变效率得到了很大的提高,大大推进了微生物诱变育种的发展,但是定点突变法只适用于基因序列已清楚、蛋白质3维结构已弄清和蛋白结构与功能关系比较清楚的基因。

3.2.1 Kunkel法定点突变

Kunkel法是1985年Kunkel[40]发明的一种寡核苷酸引物的一种诱变方法,原理是利用了一种对尿嘧啶取代的DNA的选择作用,将复制型的M13噬菌体转染到脱氧尿苷三磷酸酶和尿嘧啶脱糖苷酶双缺陷的大肠杆菌(dut-,ung-)菌株中生长,使DNA中的T被U取代。其中带U的就是DNA模板,用带突变碱基的寡核苷酸引物进行复制,从而产生异源双链。将此双链转化到含尿嘧啶脱糖苷酶的菌株中生长,由此来破坏含U的DNA模板链,从而使子代DNA链中大部分(80%)都含突变碱基序列。

王贤舜等[41]用Kunkel法,对枯草杆菌蛋白酶E进行定点诱变来提高蛋白酶E的抗氧化性,构建了工程菌PW8888,蛋白酶E的活性大幅提高,在过氧化氢浓度1 mol/L的溶液中,25 ℃保温14 h,酶活性仍然为原酶的95%以上,而野生型菌株蛋白酶E在过氧化氢浓度1 mol/L的溶液中,25 ℃保温30 s,酶活性就下降到原酶的68%,2 min后只有原酶的20%。

3.2.2 CRISPR系统基因编辑技术

CRISPR系统是指在细菌及古菌中被发现的规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats),其工作原理(图3):当外源DNA入侵时,CRISPR会在前导区的调控启动下被转录为RNA前体,在体内酶的作用下被加工成成熟的crRNA,最终与外源DNA识别结合并发挥剪切作用[42]。

图3 Crispr Cas9系统工作原理

该系统可以识别靶向序列而完成DNA的双链切割被改造为基因编辑工具,其中CRISPR/Cas9系统因其特异性强、效率高和设计简单等优点被广泛应用在基因编辑技术中,彻底改变了基因组工程领域。中国科学院Liu等[43]已将该技术应用到产纤维素酶的两株真菌M.yceliophthorathermophila和M.heterothallica中,并用于嗜热支原体和异种支原体的高效多重基因组构建。该CRISPR/Cas9系统通过NHEJ介导有效的突变基因组中导入的AMDS基因,选择纤维素酶产生途径的基因cre-1,res-1,gh1-1和alp-1作为编辑目标,通过新霉素选择标记整合,实现了4个不同位点的多基因同时中断。利用该技术获得了多株高产纤维素酶的菌株,且胞外分泌蛋白和木质纤维素酶活性较原始菌株分别提高了5倍和13倍。Toru等[44]对丝状真菌链孢霉(Neurosporacrassa)展开了研究,在模式生物脉孢菌中运用CRISPR/Cas9系统进行了有效基因的替换,利用Cas9内切酶和单个crRNA:tracrRNA嵌合引导RNA,发现用β-微管蛋白启动子代替内源性clr-2启动子能够显著增加多种纤维素酶的表达。研究表明:CRISPR/Cas9系统对生物脉孢菌有效,可能适用于自然分离的脉孢菌和其他丝状真菌。

CRISPR系统在飞速发展的同时该系统的脱靶效应也是一个不容忽视的问题,造成脱靶效应主要是由于核酸酶的结构、靶基因的复杂性[45],可以通过改造系统元件或改用不同的策略方法增加CRISPR系统基因编辑的特异性。

3.2.3 基因过表达

基因过表达是指将某个基因大量表达的过程,基因过表达可以在原生细胞中,也可以在其他表达系统中,如可以在大肠、酵母表达系统中表达。通过基因过表达提高产物的基本原理是在目的基因的上游加入调控基因,使目的基因实现大量转录和翻译,从而提高目的基因调控的次级代谢产物的产量。徐冬梅等[46]以传统诱变后的菌株(S.hygroscopicus)17-1为研究对象,通过过表达雷帕霉素的正调控基因RapG成功构建(S.hygroscopicus)17-G,雷帕霉素的产量提高了40%,为其他使用过表达正调控基因提高产量的工作提供了参考。

综上所述,定点突变对于基因序列明确、次级代谢产物生物合成途径明确的生物体有着不可否认的作用,能够在短时间内得到高产菌株,比传统的物理、化学诱变技术省时省力,能够通过定点突变有目的性地改变遗传物质,得到理想产物的菌株。基因序列明确、次级代谢产物生物合成途径明确的药用微生物只占小部分比例,大部分药用微生物的基因序列未明确,这时就无法使用定点突变的手段来进行诱变处理,可以选择基因重排、核糖体工程这些非定位突变的手段来改造菌株。

4 复合诱变

菌株在长时间使用同一种诱变剂后会出现诱变剂疲劳效应,还会造成菌株的生长周期延长、孢子数量下降和突变谱变窄等问题,这些问题在实际诱变中常使用复合诱变的方法来避免。复合诱变有两种方法:一种是诱变剂重复使用两次或两次以上,另一种是两种或两种以上诱变剂同时使用。普遍认为,复合诱变具有协同效应,诱变效果比单一诱变因子诱变好。

邓新云等[47]对黑曲霉YZ-35菌株进行了紫外诱变与硫酸二乙酯(DES)复合诱变研究,得到了一株柠檬酸高产菌株YZ-DE-3,柠檬酸产量较原始菌株提高了50.23%,进行遗传稳定性分析后表明突变体产酸遗传特性稳定。游玟娟等[48]以红曲霉(Monascussp.3.00567)为出发菌株,进行了(UV+DES)复合诱变处理,最终得到一株稳定高产菌株(Monascussp.)UV-D-9,洛伐他汀产量达到(2 890±20)mg/L,相对于出发菌株提高了82.9%,有良好的工业化价值。焦雪茜等[49]通过对根癌土壤杆菌(Rhizobiumradiobacter)进行紫外诱变结合离子束诱变选育辅酶Q10的高产菌株,结合抗性筛选获得高产菌株Y80-58-23,其菌株的辅酶Q10产量稳定,与出发菌株相比产量提高了66.1%,达到了105.8 mg/L。张奎普等[28]比较了单因素诱变法和复合诱变法对盐霉素产生菌白色链霉菌(Streptomycesalbus)S12的效果。S12菌株在距离254 nm的紫外灯12 cm处照射6 min后得到突变株,正突变率仅有3%,得到的最高效价是(26.0±1.8)mg/L,仅比原始菌株提高30%。后续又通过将紫外诱变和核糖体工程相结合,对S12菌株进行复合诱变,得到了一株具有四环素和氯霉素抗性的突变株,摇瓶发酵产量达到34 712 mg/L,是亲本菌株的2倍以上。王靓[50]通过ARTP和基因重排技术复合诱变L-聚赖氨酸产生菌,最后筛选出了一株高产菌GSG-1,ε-LP的摇瓶发酵产量达到3.56 g/L,较原始菌株G67提高了87.3%,通过诱变育种技术得到突变株后对L-聚赖氨酸的生物合成途径进行了初探。通过对高产菌株GSG-1和原始菌株G67基因测序分析对比后初步解析了GSG-1的高产机制:GSG-1对比原始菌株缺少了葡萄糖脱氢酶基因(EC1.1.1.47)、乙酰-CoA连接酶基因(EC6.2.1.13)、L-Lys氨基变位酶基因(EC5.4.3.2)和L-Lys 6-氨基转移酶基因(EC2.6.1.36)。以上基因的缺失增大了GSG-1菌株中TCA循环通量,副产物合成量减少,L-聚赖氨酸的前体L-Lys分解途径减弱,从而增加L-聚赖氨酸的产量。

综上所述,复合诱变在实际操作当中运用非常广泛,因为化学诱变等诱变剂反复使用,导致突变谱变窄、突变率降低,长期使用难以得到性状优异的突变株,研究者通常以首先使用单因素诱变后再用复合诱变的方式来提高菌株的突变率,且大部分复合诱变的正突变率和效价提高率均大于单因素诱变。

5 结 论

微生物诱变育种技术已成为提高其次级代谢产物产量和质量的有效技术手段,且在工业化育种实践中得到了广泛运用。然而,大部分药用微生物的诱变机理研究还不深入,育种工作还存在较大的盲目性。同时,传统诱变手段如紫外诱变、化学诱变均有一定的局限性,如诱变源单一反复使用往往导致正突变率降低,诱变菌株不稳定、突变谱变窄和菌株对诱变剂敏感度降低等,这些问题导致微生物先导物规模化制备产品质量不一致,严重限制其药物开发与临床应用。随着基因测序工程和蛋白质工程的快速发展,越来越多的药用微生物基因组序列被阐明,其先导物生物合成相关基因功能被验证,先导物生物合成路线越来越清晰,这为有目的诱变育种提供了很大支持。因此,利用生物信息技术、基因组和蛋白质组技术,结合传统诱变手段改造药用微生物,可以更有效地诱变育种,获得高产、稳定和优质的工业菌株。