磷酸甜菜碱在L-赖氨酸发酵中的应用

李万军,赵春光,方海田

(1.宁夏食品微生物应用技术与安全控制重点实验室,宁夏 银川 750021;2.宁夏大学 食品与葡萄酒学院,宁夏 银川 750021;3.宁夏伊品生物科技股份有限公司,宁夏 银川 750100)

L-赖氨酸是人类和动物所必需八大氨基酸之一[1]。在医疗方面应用非常广泛,比如防治骨质疏松症,提高机体的免疫功能和对传染病的抗病能力[2],又如赖谷复合盐用于治疗慢性脑组织缺血、颅脑外伤病及缺氧性疾病的脑保护[3],还可以用于治疗单纯疱疹病毒和带状疱疹引起的唇疱疹[4]等。近年来,90%以上的L-赖氨酸产品用于饲料添加剂[5],各大生产企业相继扩能投产,行业竞争惨烈。如何提高赖氨酸发酵糖酸转化率、降低设备腐蚀,是降低生产成本提高企业竞争力的关键点。甜菜碱作为发酵促进剂在氨基酸发酵中应用的研究很多,总结其主要功能包括两点:1)维持和调节细胞渗透压。当外界渗透压发生剧烈变化时,细胞吸收或合成的甜菜碱通过稳定蛋白质结构、提高钾钠泵功能和阻止胞内水分丢失等方式增加细胞对渗透压的抗性。黄登高等[6]在研究乳酸发酵时发现,甜菜碱能够提高高糖浓度下乳酸菌的细胞生长速率和乳酸脱氢酶的活力,进而提高乳酸产量。2)参与甲基化反应。常立群等[7]发现在谷氨酸发酵中添加适量甜菜碱可提高谷氨酸产酸。刘丽君[8]在L-异亮氨酸产生菌的选育及发酵条件研究中介绍到,通过添加甜菜碱2.5 g/L使得苏氨酸发酵周期缩短12 h,L-异亮氨酸产量提高66.3%。赵琳琳[9]在脱氮假单胞菌产VB12发酵过程中甜菜碱作用机理及其补料策略的研究中介绍了甜菜碱在发酵过程中作用机理,甲基参与合成甲硫氨酸、VB12和丙氨酸等多种物质,并指出甜菜碱分子中含有3个甲基,是高效的甲基供体,还得出甜菜碱质量浓度在2～3 g/L时菌浓增加了10.5%,VB12产量增加了23.8%的结论。

磷酸甜菜碱是甜菜碱的磷酸盐,在赖氨酸发酵中应用研究较少。目前,大多数企业在赖氨酸发酵配方中添加一定量的氯化胆碱起到调节渗透压、提供甲基化反应的甲基的作用,但氯化胆碱中氯离子对设备腐蚀性严重。“中国饲料行业信息网”报道,市场上质量分数为21%的氯化胆碱价格逐年上涨,2016年均价5 400元/吨,2017年涨至6 319.5元/吨,2018年涨至15 000元/吨,已经造成赖氨酸发酵成本上升10元/吨理论酸,而磷酸甜菜碱市场价格2016年为9 600元/吨、2017年8 952元/吨、2018年13 500元/吨。相比之下磷酸甜菜碱价格上涨幅度较小。因此,笔者继续实验了磷酸甜菜碱替代氯化胆碱在赖氨酸发酵中的应用,可为提高赖氨酸发酵指标、降低生产成本提供方向。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 种

伊品生物科技股份有限公司菌种中心提供赖氨酸生产用菌。

1.1.2 实验配方

三级种子基础配方:MnSO4质量2 kg,FeSO4质量2 kg,KH2PO4质量60 kg,K2HPO4质量60 kg,(NH4)2SO4质量250 kg,MgSO4质量30 kg,玉米浆体积2.0 m3,消泡油质量6 kg,铜锌质量适量,定容体积35 m3。

发酵底料基础配方:MnSO4质量25 kg,FeSO4质量25 kg,KH2PO4质量160 kg,K2HPO4质量160 kg,H3PO4质量100 kg,(NH4)2SO4质量800 kg,MgSO4质量250 kg,玉米浆体积5.0 m3,消泡油质量200 kg,铜锌质量适量,定容体积240 m3。

总氮基础配方:MnSO4质量20 kg,FeSO4质量20 kg,KH2PO4质量250 kg,K2HPO4质量250 kg,MgSO4质量500 kg,消泡油质量100 kg,定容体积30 m3。

1.1.3 实验设备

体积为2 500 L的二级种子培养罐,5 000 L的三级种子培养罐,47 000 L的发酵罐,20 000 L配料罐,三级种子连消系统,底料连消系统,浓糖连消系统,硫铵连消系统,浓糖流加罐,硫铵流加罐,720型紫外分光光度计,100 mL容量瓶,0～1 000 mL移液枪,1 mL移液管,吸耳球,洗瓶等。

1.2 实验设计

在现有三级种子基础配方上分别用质量浓度0.3,0.5,0.7,0.9 g/L的磷酸甜菜碱替代氯化胆碱,定容30 m3,接种量体积为1 500 L,OD为0.5的二级种子液,培养温度30 ℃,PH实测6.95,溶氧控制>30%,初糖流加量均不变,在成熟净OD均为0.45的情况下对比成熟周期,确定成熟周期最短时磷酸甜菜碱的用量即为最佳用量。

在现有总氮配方基础上添加磷酸甜菜碱,设计起始流加时间、总氮中磷酸甜菜碱添加浓度、糖氮比(浓糖与总氮的流加体积比)的三因素多水平正交实验,对比转化率得出最佳添加质量浓度、流加起始时间和糖氮体积比。

1.3 分析测定方法

1.3.1OD值检测方法

取1 mL发酵液,用100 mL容量瓶稀释100倍,使用720型分光光度计在600 nm波长下检测OD值。

1.3.2 发酵液中赖氨酸质量浓度的测定

赖氨酸质量浓度采用茚三酮显色法测定。

步骤1用赖氨酸标样配置质量浓度为10 g/L赖氨酸盐酸盐标液,分别取2,3,4,5,6 mL赖氨酸盐酸盐标液至100 mL容量瓶中,用去离子水定容至100 mL,得到质量浓度分别为0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 g/L的赖氨酸盐酸盐标样。

步骤2发酵液稀释150～500倍数,用离心机3 500 r/min离心10 min,得到样品上清液。

步骤3用1支10 mL试管,取pH 1.3的茚三酮溶液1 mL,加入样品离心上清液1 mL,再用5支10 mL试管,各取PH 1.3的茚三酮溶液1 mL,分别加入质量浓度为0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 g/L的赖氨酸盐酸盐标样1 mL,摇匀后在沸水浴中加热10 min,取出冷却至室温,在以上6支试管中继续各加8 mL去离子水,摇匀后用720型分光光度计在475 nm波长下检测吸光值。

步骤4在Excel中以赖氨酸盐酸盐标样质量浓度为纵坐标,吸光值为横坐标绘制标准曲线,得出标准曲线公式,再将样品吸光值代入标准曲线公式中计算出发酵液中赖氨酸质量浓度。赖氨酸发酵糖酸转化率计算公式为

糖酸转化率=(产量/加糖量)×100%

1.4 数据统计方法

1)采用SAS随机区组分析法分析磷酸甜菜碱对三级种子活力影响。

2)采用SPSS软件设计影响磷酸甜菜碱流加因素的正交实验,并对实验结果做方差分析,确定最佳流加条件。

统计方法分析结果中的F表示自变量对因变量的影响大小;p表示自变量对因变量影响大小的显著度,当p>0.05时表示影响不显著或无统计学意义,当0.01

2 结果与分析

2.1 磷酸甜菜碱对赖氨酸三级种子活力的影响

通过在赖氨酸三级种子配方中添加不同质量浓度的磷酸甜菜碱,培养周期均为12 h,培养过程中每2 h检测1次OD值,记录得到表1实验数据,根据表1数据绘制图1曲线。成熟周期指种子OD值达到成熟OD值时的种子培养周期,可通过绘制种子OD生长曲线看出,曲线斜率最大(即菌体分裂速率最快)的周期确定为成熟OD值。

表1 磷酸甜菜碱三级成熟周期影响结果

图1 三级种子OD生长曲线图

通过SAS软件对表1中2～5批次实验数据作随机区组方差分析,结果如下:

1)本例模型(ODij=U+Xi+Yj,X为添加量,Y为培养周期)的F=329.7,p=0.000 1<0.05,说明模型有统计学意义。

2)磷酸甜菜碱添加量的F=10.62,p=0.000 1<0.05,说明各区组均数之间有显著差异,即不同磷酸甜菜碱添加量对三级种子OD值影响显著。

3)不同培养周期的F=584.97,p=0.000 1<0.05,说明各处理组均数之间的差异有统计学意义,即三级种子随着培养时间延长OD不断增高。

从表1中可以看出:磷酸甜菜碱添加量0.3 g/L和0.5 g/L时对三级种子OD值影响最显著,当磷酸甜菜碱添加量提高至0.7 g/L和0.9 g/L时对三级种子OD值影响显著性降低。

综合实验结果及数据分析得出结论:三级种子配方中添加量0.5 g/L磷酸甜菜碱可替代0.5 g/L的氯化胆碱,而且磷酸甜菜碱能显著提高种子活力,缩短成熟周期1.5 h。

通过配对T检验考查添加量0.3 g/L磷酸甜菜碱与添加量0.5 g/L氯化胆碱对三级种子OD值是否有显著差异,分析结果如表2所示,其中p=0.692>0.05表示2组数据无显著差异,即可用磷酸甜菜碱替代原配方中的氯化胆碱。

表2 配对T检验试验1,2批次之间的OD差异

2.2 磷酸甜菜碱对赖氨酸发酵的影响

发酵罐配方中添加磷酸甜菜碱,质量浓度分别为0,0.3,0.5,0.7,0.9 g/L,每个质量浓度实验3批次,每2 h检测1次OD值,并绘制各质量浓度条件下发酵罐OD曲线如图2所示,同时得出发酵罐配方中添加不同质量浓度磷酸甜菜碱对发酵指标影响的实验结果如表3所示。通过SPSS软件分析表3实验数据,得出结果见表4。通过在赖氨酸发酵底料中添加一定量的磷酸甜菜碱,发酵OD峰值、放罐产酸和转化率(p=0<0.01)均显著提高,其中OD峰值、放罐酸与磷酸甜菜碱添加量成正相关,而且当添加量由0.5 g/L提高到0.9 g/L时,发酵罐稳定期显著延长(图2)。随着发酵OD值增高,发酵转化率表现略微下降趋势。总体看赖氨酸发酵底料中添加磷酸甜菜碱的质量浓度为0.5 g/L时转化率最高71.18%,发酵液中L-赖氨酸质量浓度263 g/L。

图2 磷酸甜菜碱对发酵OD曲线影响图

表3 磷酸甜菜碱对发酵指标的影响

表4 方差分析结果

2.3 总氮配方中添加磷酸甜菜碱对赖氨酸发酵的影响

以发酵运行中总氮起始添加时间(A)、磷酸甜菜碱在总氮中添加质量浓度(B)、糖与氮的体积比(C)为3个考查因素,以赖氨酸转化率为因变量,采用SPSS软件设计三因素五水平正交实验,实验结果如表5所示,SPSS软件对实验结果表5进行分析,其结果如表6所示。

表5 正交实验结果

表6 主体间效应的检验

从表6中可以看出:该模型p=0.001<0.01,说明模型极显著,R2=0.886,R2越接近1,说明模型拟合度良好,方程的显著性及可靠性极高。Ⅲ平方和比较B>A>C,说明3个因素对转化率影响大小依次为B,A,C。总氮中磷酸甜菜碱添加质量浓度(B)对赖氨酸糖酸转化率影响极其显著(F=12.934,p=0<0.01);起始流加时间(A)对赖氨酸糖酸转化率影响极其显著(F=7.94,p=0.002<0.01);糖氮体积比(C)对赖氨酸糖酸转化率影响最小,不显著(F=2.445,p=0.103>0.05)。

采用SPSS软件对表5实验数据方差分析,得出主因素A,B对赖氨酸转化率影响的95%置信区间,其结果如表7,8所示。

表7 B因素对赖氨酸发酵转化率的影响

由表7得出:总氮中磷酸甜菜碱添加质量浓度(B)为8 g/L时糖酸转化率达到最高水平,置信区间最高(71.253%～71.319%),为最佳添加质量浓度;质量浓度低于4 g/L或高于12 g/L时糖酸转化水平明显下降。由表8得出:总氮起始流加时间(A)为5～7 h时,赖氨酸的糖酸转化水平达到最高,置信区间最高(71.239%～71.305%),当9 h开始流加后,糖酸转化率下降明显。

表8 A因素对赖氨酸发酵转化率的影响

3 讨 论

三级种子活力、发酵罐OD峰值都影响着发酵罐指标,通过以往生产数据分析:当三级种子成熟周期大于9 h时,发酵罐OD峰值提前、耗糖速率下降,单产及转化率等生产指标下降明显,对生产极为不利。分析原因在于三级种子培养后期菌体密度增大,而通风、搅拌功率和罐压都提高到了极限,造成种子长期缺氧,在逆生长环境下用于生产的基因工程菌为了适应生存,菌体内过表达的产酸促进基因片段会大量丢失,造成菌体增殖活性增加而产酸能力下降,最终导致发酵指标显著下降。添加一定量磷酸甜菜碱起到了以下3个重要作用:

1)维持和调节细胞渗透压。当外界渗透压发生剧烈变化时,细胞吸收或合成的甜菜碱通过稳定蛋白质结构、提高钾钠泵功能、阻止胞内水分丢失等方式增加细胞对渗透压的抗性[10]。

2)参与甲基化反应。甲基参与DNA甲基化反应[11],生产菌的遗传物质DNA经过甲基化修饰,其遗传及表达稳定性提高,有利于赖氨酸发酵过程中菌体产酸能力的保持。而甜菜碱分子中含有3个甲基,DNA甲基化修饰提供了甲基供体。在甲基化反应中,甜菜碱-高半胱氨酸甲基转移酶能够催化甜菜碱向高半胱氨酸转移一个甲基,分别生成二甲基甘氨酸和甲硫氨酸,后者为VB12的合成提供甲基[12]。而甲硫氨酸、VB12都有利于赖氨酸生产菌生长繁殖。

3)磷酸甜菜碱中的磷酸根离子提高培养基中的溶磷,溶磷是限制菌体生长的主要因素,它参与菌体细胞壁、细胞膜构成,同时磷参与葡萄糖磷酸化分解以及ATP,AMP和AGP等能量物质的转化。因此磷酸甜菜碱替代氯化胆碱后,三级种子成熟周期、发酵罐OD峰值周期都明显缩短。

三级种子及发酵罐底料中添加磷酸甜菜碱后将三级种子成熟周期缩短1.5 h,发酵罐OD由对照组均值0.727提高到0.875,发酵产酸较对照组提高10 g/L,转化率也有一定提升但不显著。原因分析有两点:

1)在于赖氨酸发酵过程有中间放料,随着中间放料菌体及底料营养大量流失,造成OD峰值回降迅速,最终影响产酸及转化率。工业化生产上通过在赖氨酸发酵过程中流加总氮的方式补充营养,维持菌体中后期活性[13]。

2)菌体内合成的赖氨酸需要通过细胞膜赖氨酸外排泵排出胞外[14],在发酵中后期发酵液中赖氨酸质量浓度高与胞内质量浓度,造成细胞渗透压增高。通过总氮添加一定量的磷酸甜菜碱,当发酵中后期外界渗透压发生剧烈变化时,细胞吸收的甜菜碱发挥其维持和调节细胞渗透压的特性,能够通过稳定蛋白质结构、提高钾钠泵功能、阻止胞内水分丢失等方式增加细胞对渗透压的抗性[15]。从而降低了发酵中后期破胞、提高了赖氨酸发酵转换率。

4 结 论

现常用的发酵促进剂有氯化胆碱、甜菜碱盐酸盐和蛋氨酸等,其中前两者含有大量氯离子不能被菌体利用,导致大量氯离子残存于发酵液中,对发酵罐及后提取设备造成很大腐蚀,严重影响设备使用寿命,而且经常引起设备微漏造成发酵罐染菌。磷酸甜菜碱作为新型发酵促进剂,其中的磷酸根离子可以直接被菌体利用,甜菜碱可以参加甲基化代谢和调节细胞渗透压,减少细胞破碎。研究表明:磷酸甜菜碱替代等量氯化胆碱,可显著提高三级种子生长速率、缩短成熟周期。赖氨酸发酵OD值、放罐酸与底料中磷酸甜菜碱添加量成正相关,发酵配方中磷酸甜菜碱添加量为添加0.5 g/L时转化率、产酸达到最优。总氮中磷酸甜菜碱最佳使用条件为:质量浓度为8 g/L、添加时间为发酵罐运行5～7 h、糖氮体积比控制在20～28。研究结果对降低赖氨酸生产成本、降低氯离子对设备腐蚀有指导意义。