泥胡菜不同极性溶剂萃取物中总酚和总黄酮含量及抗氧化活性测定

朱莹，陈达鑫，王美玲，林珊*

（1.福建卫生职业技术学院，福建 福州 350101；2.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；3.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122）

泥胡菜Hemisteptia lyrataBunge为菊科泥胡菜属植物，广泛分布于我国各地，具有清热解毒、消肿祛瘀的作用，临床上已有报道可用来治疗痔漏、痈肿、疔疮、外伤出血和骨折等疾病［1］。泥胡菜主要化学成分为黄酮、甾醇和木脂素等［2-7］。研究表明癌症、动脉硬化、糖尿病等疾病的发生和发展与过剩的活泼氧自由基有关［8-9］，而多酚类和黄酮类化合物具有抗氧化和清除自由基的作用［10-11］。泥胡菜能抑制80%氯仿（CCl4）酒精溶液所诱导的小鼠肝脏脂质过氧化，具有良好的抗氧化活性［12］。但目前尚未报道对泥胡菜有效成分进行抗氧化实验研究。所以本实验通过对泥胡菜不同极性溶剂萃取物进行总酚及总黄酮的含量测定，采用不同反应机制的抗氧化方法，对不同提取物的抗氧化活性能力进行全面的评价。探讨不同萃取物的抗氧化作用，分析不同抗氧化活性指标与总酚、总黄酮含量之间的关联，为泥胡菜临床应用提供理论依据，为寻找天然的抗氧化剂提供新的途径，并为下一步合理开发和利用泥胡菜药材资源提供参考。

1 试药与仪器

1.1 试药 泥胡菜样品采自福建省永春县，经福建中医药大学杨成梓教授鉴定为菊科植物泥胡菜Hemisteptia lyrataBunge。没食子酸、芦丁对照品（纯度≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司）；维生素C（上海源叶生物科技有限公司）；福林酚试剂（北京索莱宝科技有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、吩嗪硫酸甲酯（PMS）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、水杨酸试剂（美国Sigma公司）；碳酸钠、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、铁氰化钾、三氯乙酸、硫酸亚铁、过氧化氢、乙醇等所有试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器 UV-1800紫外可见分光光度计（日本Shimadzu公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵、RZ01C旋转蒸发器、HH-S恒温水浴锅（郑州长城科技工贸有限公司）；SFG-02B电热恒温鼓风干燥箱（黄石市恒丰医疗器械有限公司）；KQ-500E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AR2130电子天平（奥豪斯仪器有限公司）；CP225D电子天平（德国Sartorius公司）；Elix5纯水制备系统（厦门精艺兴业科技有限公司）。

2 方 法

2.1 不同萃取部位提取物制备 精密称取泥胡菜全草干燥粗粉300 g，加10倍量50%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并提取液，减压回收至无乙醇，3 600 r/min离心10 min，上清液浓缩至干，得乙醇浸膏，备用。取适量乙醇浸膏，加入10倍量的超纯水超声溶解，依次用10倍量的石油醚、氯仿、乙酸乙酯及水饱和正丁醇分别萃取3次，合并萃取液，减压回收溶剂，浓缩蒸干，得到各萃取部位的浸膏，备用。

2.2 总酚含量测定

2.2.1 标准曲线制备 精密称量没食子酸对照品4.10 mg，置于25 mL量瓶中，加入适量60%乙醇，超声处理至完全溶解，加60%乙醇至刻度，得到0.164 mg/mL 没食子酸对照品溶液。精密吸取对照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL置于10 mL具塞刻度试管，加蒸馏水3 mL，加10%福林酚试剂2.5 mL，加7.5% 碳酸钠溶液2 mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，暗处放置30 min 后，采用紫外分光光度法于742 nm波长处测吸光度值。以吸光度值为纵坐标，对照品的浓度为横坐标，绘制标准曲线为Y＝86.95X＋0.004 6，r2＝0.999 7，线性关系良好。

2.2.2 样品总酚测定 将各受试样品用超纯水分别配制成5.10 mg/mL乙醇浸膏溶液、10.03 mg/mL石油醚浸膏溶液、5.06 mg/mL氯仿浸膏溶液、2.54 mg/mL乙酸乙酯浸膏溶液和饱和5.04 mg/mL正丁醇浸膏溶液，分别从中精密吸取0.10 mL置于10 mL具塞刻度试管，按“2.2.1”项下的方法进行含量测定，取3次平均值，计算样品中总酚含量。

2.3 总黄酮含量测定

2.3.1 标准曲线制备 精密配制0.2 mg/mL芦丁对照品60%乙醇溶液。吸取对照品溶液 1、2、4、6、8 mL，分别置于25 mL量瓶中，各加5%的亚硝酸钠0.75 mL，摇匀静置5 min，再加入10%硝酸铝溶液0.75 mL，摇匀静置5 min，再加入1 mol/L的氢氧化钠溶液10 mL，摇匀后用60%乙醇稀释至刻度，静置10 min后用紫外分光光度法在510 nm进行测定，以水为空白对照，测定吸光度。以吸光度为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y＝10.156X＋0.024 8，r2＝0.999 8，线性良好。

2.3.2 样品总黄酮测定 将各受试样品加入60%乙醇配制成5 mg/mL石油醚浸膏溶液、5 mg/mL氯仿浸膏溶液、2 mg/mL乙酸乙酯浸膏溶液和5 mg/mL饱和正丁醇浸膏溶液，分别从中精密吸取1 mL置于25 mL容量瓶，按“2.3.1”项下的方法进行含量测定，取3次的平均值，计算样品中总黄酮含量。

2.4 DPPH清除率测定 加入不同质量浓度受试样品（0.1～0.5 mg/mL）1 mL及0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液3 mL，摇匀，室温避光反应20 min 后，于517 nm处测定吸光度值A1，样品溶剂代替样品溶液测吸光值A0，维生素C（0.1～0.5 mg/mL）做阳性对照。根据公式计算清除率＝（A0－A1）/A0×100%，计算半数抑制浓度IC50。

2.5 羟自由基清除率测定 加入不同质量浓度受试样品（0.1～0.5 mg/mL）0.5 mL、1 mmol/L的FeSO4溶液2 mL及1 mmol/L H2O2溶液3 mL，混匀，加入1 mmol/L水杨酸溶液3.5 mL，混匀后置于37 ℃水浴中恒温保持15 min，于510 nm波长处测定吸光值A1，样品溶剂代替样品溶液测吸光值A0，维生素C（0.1～0.5 mg/mL）做阳性对照。根据公式计算清除率＝（A0－A1）/A0×100%，计算半数抑制浓度IC50。

2.6 超氧阴离子自由基清除率测定 加入不同质量浓度受试样品（0.2～1.0 mg/mL） 1 mL、0.2 mmol/mL的NBT溶液1 mL和0.5 mmol/mL的NADH溶液1 mL，最后加入0.2 mmol/L的PMS溶液0.4 mL，摇匀，室温静置5 min后，于560 nm处测定吸光度值A1，样品溶剂代替样品溶液测吸光值A0，维生素C（0.2～0.6 mg/mL）做阳性对照。根据公式计算清除率＝（A0－A1）/A0×100%，计算半数抑制浓度IC50。

2.7 铁离子还原能力测定 加入不同质量浓度受试样品（0.2～1.0 mg/mL）1 mL、0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH值6.6） 2.5 mL及1%铁氰化钾溶液定容至2.5 mL，50 ℃水浴中保温20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸，混匀，静置10 min。取上清液2.5 mL，加入0.1% FeSO4溶液0.5 mL，静置10 min，于700 nm处测定吸光值A1，样品溶剂代替样品溶液测吸光值A0，维生素C（0.05～0.25 mg/mL）做阳性对照。以吸光值大小表示还原能力大小A＝A1－A0。

2.8 统计学方法 所有实验数据至少重复3次，计量资料符合正态分布以（±s）表示。应用Graphpad prism 6.0软件绘制浓度依赖曲线图及其对应的IC50柱状图，根据均值评估泥胡菜不同极性部位的抗氧化能力。

3 结 果

3.1 总酚和总黄酮含量 结果表明，泥胡菜不同萃取部位浸膏得率不同，总酚和总黄酮的含量也各有差异，其中乙酸乙酯部位提取率最低，但浸膏中总酚和总黄酮含量最高。泥胡菜不同极性部位中总酚含量从高至低依次为乙酸乙酯＞正丁醇＞氯仿＞石油醚；总黄酮含量从高至低依次为乙酸乙酯＞氯仿＞正丁醇＞石油醚，见表1。从表中还可以看出，用低极性或高极性溶剂萃取所得黄酮类和酚类化合物的含量比中极性溶剂萃取所得要低。同时，总酚＋总黄酮含量，乙酸乙酯部位最高，氯仿和正丁醇相近，石油醚部位最低。综上所述，乙酸乙酯最适用于泥胡菜中酚类和黄酮类化合物的提取。

表1 泥胡菜不同极性溶剂萃取部位总酚和总黄酮含量比较（±s） %

表1 泥胡菜不同极性溶剂萃取部位总酚和总黄酮含量比较（±s） %

提取部位石油醚浸膏氯仿浸膏乙酸乙酯浸膏正丁醇浸膏提取率/%1.30 0.75 0.42 1.17总酚含量（以没食子酸计）4.08±0.46 14.79±0.58 55.04±0.58 20.83±0.75总黄酮含量（以芦丁计）12.36±4.32 19.90±5.12 62.11±4.97 15.40±4.92

3.2 清除DPPH自由基能力 由图1A可得，不同部位均有较强的清除DPPH自由基的作用。当质量浓度在0.1～0.5 mg/mL时，抗氧化活性随着样品质量浓度的增大而增强，但抗氧化能力均低于阳性对照维生素C。乙酸乙酯和氯仿部位的清除能力较接近，石油醚和正丁醇比较接近。由图1B可见，乙酸乙酯部位清除DPPH自由基能力最高，IC50值最低，清除能力是乙酸乙酯＞氯仿＞正丁醇＞石油醚。比较各部位总酚及总黄酮含量可知，不同萃取部位清除DPPH自由基能力与其总黄酮及总酚的量在0.1～0.5 mg/mL浓度范围内呈剂量依赖。

图1 泥胡菜不同极性溶剂萃取物清除DPPH自由基能力

3.3 清除羟基自由基能力 由于羟自由基极强的氧化性能，对羟自由基的清除能力是反映药物抗氧化作用的重要指标之一。由图2A可知，泥胡菜不同极性溶剂萃取物都表现出一定的羟基自由基清除活性。在质量浓度范围内（0.1～0.5 mg/mL），不同萃取部位清除羟基的能力随着样品浓度的增大而表现出增强的趋势。乙酸乙酯部位表现出最高的羟基自由基清除能力，氯仿、正丁醇和石油醚部位的清除能力较接近。由图2B可得，根据IC50值可知清除羟基自由基能力是乙酸乙酯＞氯仿＞正丁醇＞石油醚。不同萃取部位清除羟基自由基的能力与其总黄酮及总酚的量在0.1～0.5 mg/mL浓度范围内呈剂量依赖。

图2 泥胡菜不同极性溶剂萃取部位清除羟基自由基能力

3.4 清除超氧自由基能力 通过NADH-PMS-NBT体系检测超氧阴离子清除活性，由图3A可以看出，泥胡菜不同萃取部位清除超氧自由基作用最强是乙酸乙酯部位，但明显低于维生素C，不同萃取部位抗氧化活性随浓度呈现量效关系。由图3B可得，根据不同萃取部位超氧阴离子自由基IC50可知，清除能力是乙酸乙酯＞氯仿＞正丁醇＞石油醚。

图3 泥胡菜不同极性溶剂萃取部位清除超氧自由基能力

3.5 还原能力 抗氧化剂是通过自身的还原作用清除自由基，还原力越大，抗氧化性越强。由此可根据还原力的大小来判断其抗氧化活性的大小，吸光度越大，表明还原能力越强。从图4可以看出，随着样品质量浓度的增加，还原力不断增强，且浓度与还原力呈正相关。当质量浓度为0.2 mg/mL时，泥胡菜不同萃取部位的还原能力吸光值分别为石油醚（0.018±0.001）、氯仿（0.043±0.010）、乙酸乙酯（0.077±0.018）和正丁醇（0.026±0.007），而在相同质量浓度下，阳性对照维生素C可达到（1.593±0.202）。可见不同萃取部位的还原能力远低于阳性对照维生素C。在各受试质量浓度下，各样品还原能力相近，这表明泥胡菜不同萃取部位提取物对还原能力影响小。

图4 泥胡菜不同极性溶剂萃取部位还原能力

4 讨 论

泥胡菜为福建省特色药材之一，民间全草入药，始载于《救荒本草》。本系列研究在前期运用色谱指纹图谱技术和开展福建泥胡菜抗乳腺癌活性筛选的基础上，进一步阐明泥胡菜抗氧化的活性成分部位与药效之间的相关性，应用于泥胡菜质量控制，为追踪分离目标活性成分和开发中药新药提出新的思路和方法，对提高泥胡菜的药用价值和促进海西建设都具有重大意义。

本研究基于已有文献进行条件优化［13-14］，泥胡菜不同溶剂萃取物的抗氧化能力存在明显差异，根据极性不同，将泥胡菜的提取部位分为石油醚、氯仿、乙酸乙酯及正丁醇，其成分有倍半萜内脂类、木脂素类、黄酮类、酚类及内脂类化合物。其中山奈酚、芹菜素和金合欢素为泥胡菜主要的黄酮类成分，已有文献报道其具有一定抗氧化作用［15-17］。如山奈酚可降低高糖对肾小球系膜细胞的氧化应激作用，其氧化机制是通过降低尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（recombinant nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4）的活性所介导［15］。因此，泥胡菜具有抗氧化作用，但目前未见报道。由本实验结果可知，泥胡菜具有较好的清除DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子的能力，但对还原能力影响较小。同时随样品质量浓度的增大，不同萃取物在不同氧化体系中抗氧化能力都呈现逐渐增强的趋势。尤其是乙酸乙酯萃取部位总酚和总黄酮的含量最高，其在不同氧化体系中抗氧化能力也是最高；氯仿和正丁醇部位总黄酮和总酚含量相近，其抗氧化作用也相似，二者之间的抗氧化作用无明显差异，均低于乙酸乙酯部位的抗氧化活性；石油醚部位总酚和总黄酮的含量最低，其抗氧化能力也最低。结果可知，泥胡菜的抗氧化能力与泥胡菜总酚和总黄酮的含量有关。黄酮类和酚类化合物是具有较强抗氧化活性的一类物质，从实验结果可得，不同部位提取物浓度与抗氧化能力呈浓度依赖，提示酚类和黄酮类化合物可能是泥胡菜抗氧化作用的主要成分。

上述结果看出，采用化学成分分析和生物活性相结合的方式，能够更加全面、准确地评估药材的质量，丰富了泥胡菜的基础研究，为药材的开发和应用提供参考。并且有必要进一步分析泥胡菜的黄酮及酚类化合物活性成分，明确构效关系，探讨抗氧化机理，为指导临床的合理用药提供依据。