解毒消癥饮通过HIF-1/miR-210调节葡萄糖能量代谢抑制肝癌细胞增殖的生物学机制研究

鲁琴，关建华，曾建伟，林明和，林久茂，Nathaniel Weygant，曹治云*

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州350122）

目前，我国肝癌发病率和病死率在癌症疾病中位列第三［1］。通过手术、放化疗、免疫治疗、靶向治疗等虽然取得一定的进步，但因复发和转移导致的病死率仍居高不下。因此，寻找高效且低毒的抗肿瘤药物，以此来降低复发和减少转移是目前临床治疗中亟待解决的问题。缺氧是实体肿瘤常见的现象，肿瘤形成过程是肿瘤细胞对缺氧逐渐适应的过程，而低氧诱导因子1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）在这一过程中起着中枢作用［2］。HIF-1可通过形成多血管体系和提高糖酵解速率来提高肝癌细胞对低氧条件的适应性，进而抑制细胞凋亡，促进细胞增殖。miR-210（microRNA-210）是一种低氧诱导的miRNA，直接受HIF-1的调控，它的表达与HIF-1呈正相关性，目前被认为是肿瘤低氧环境下的标志性表达基因［3］。肝癌细胞在低氧的状态下，通过调控糖酵解途径的关键酶如葡萄糖转运体蛋白、磷酸甘油酸激酶等，导致糖酵解加快及乳酸生成，降低线粒体氧化磷酸化发生水平，而此过程的调控核心单元为HIF-1/miR-210。深入探讨HIF-1/miR-210诱导的能量代谢重编程具体调控机制，将为抗肿瘤药物研究提供新的治疗靶点［4-5］。

解毒消癥饮（JXY）在临床上长期被应用于消化道肿瘤患者的辅助治疗，在围放、化疗期对于消化道肿瘤中热毒炽盛型的患者，可减少复发和转移，延长患者生存期［6-9］。该中药复方还可通过抑制与内皮细胞迁移和血管生成密切相关的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）-2和MMP-9的表达，实现对低氧条件下以HIF-1为通路核心的肝癌细胞增殖及血管新生的抑制作用［10-12］。但该方通过HIF-1/miR-210回路调控能量代谢重编程具体作用机制尚未明确。本文以HIF-1/miR-210为切入点，考察JXY干预肝癌细胞在能量代谢重编程过程中相关因子的表达情况，从分子水平探讨该方调控的具体作用机制。

1 实验材料

1.1 实验细胞 人肝癌细胞株HepG2、Hep3B、Huh7，由中国科学院细胞库提供。

1.2 实验药物 JXY药物组成：白花蛇舌草30 g，山慈菇15 g，苦参15 g，夏枯草15 g，购自福建中医药大学国医堂，参照文献［10］按质量配比制备JXY乙酸乙酯提取物。

1.3 实验试剂 高糖DMEM培养基（美国GIBCO公司）；胎牛血清、胰蛋白酶、MTT（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Hoechst 33342染色试剂盒、葡萄糖含量检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；HIF-1α、人葡萄糖转运蛋白-1（glucose transporter 1，GLUT-1）、单羧 酸转 运 蛋 白-4（monocarboxylate transporter 4，MCT-4）、己糖激酶（hexokinase，HK）、磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）抗体（美国Proteintech Group公司）；引物构建于浙江尚亚生物技术有限公司。

1.4 实验仪器 超净工作台（苏州净化设备公司）；低氧细胞工作站（英国Don Whitely Scientific公司）；CO2培养箱、-80 ℃超低温冰箱（美国Thermo公司）；形态学显微图像分析系统LAS V4.1、倒置显微镜系统（德国Leica仪器有限公司）；Countes®全自动细胞计数仪（美国Life公司）。

2 实验方法

2.1 低氧与常氧培养条件 20% O2、5% CO2、37 ℃完全饱和湿度条件下常规培养为常氧培养条件；使用低氧细胞工作站（0.1% O2、5% CO2、94% N2的混合气），37 ℃条件下培养为低氧条件。

2.2 干预条件筛选

2.2.1 MTT法观察低氧和常氧条件对肝癌细胞活力的影响 将肝癌细胞株HepG2、Hep3B、Huh7分别按1.0×104个/mL均匀接种于96孔细胞培养板中，并同时分别置于低氧或常氧条件下培养，设置3个复孔。分别干预3、6、9、12、24、36、48 h后，弃去板中上清液，每孔加入10 µL的MTT（初始浓度：0.5 mg/mL）后继续培养4 h，加入含有1% NH4OH的DMSO溶解晶体至48 h后完全结束该实验。酶标仪上于492 nm 测定吸光度值。

2.2.2 Western blot法检测低氧和常氧条件对HIF-1α蛋白表达量的影响 取对数生长期的肝癌细胞接板，分别同时置于低氧或常氧条件下培养，分别在不同时间段（0.5、1、3、6、9 h）收集并提取蛋白。在干预时间结束后提取蛋白，进行电泳、转膜、一抗冷库孵育过夜，TBST洗膜，二抗摇床孵育2 h，通过Bio-Rad成像系统对蛋白指标进行成像，并使用Image J软件对获得的蛋白数据分析整理。

2.2.3 MTT法观察低氧和常氧条件下不同浓度JXY对肝癌细胞活力的影响 将肝癌细胞株HepG2、Hep3B、Huh7分别按1.0×104个/mL均匀接种于96孔细胞培养板中，同时分别置于低氧或常氧条件下培养，在细胞汇合度到达60%～70%时予以不同浓度JXY（0、0.05、0.1、0.2 mg/mL）干预，并设置3个复孔。分别干预6、9、12、24 h后，弃去板中上清液，每孔加入10 µL的MTT（初始浓度：0.5 mg/mL）后继续培养4 h，加入含有1% NH4OH的DMSO溶解晶体至48 h后完全结束该实验。酶标仪上于492 nm测定吸光度A值，按以下公式计算：

2.3 干预实验

2.3.1 细胞分组 将肝癌细胞分为常氧0 mg/mL组、常 氧0.1 mg/mL组、低 氧0 mg/mL组、低 氧0.1 mg/mL组。在细胞汇合度到达60%～70%时予以不同浓度JXY（0、0.1 mg/mL）干预，同时根据实验要求设置不同干预条件。

2.3.2 细胞爬片实验观察细胞形态 将盖玻片消毒灭菌后放入6孔板中，按“2.3.1”项下分组干预后，将盖玻片放置于苏木素溶液中染色2 min，超纯水清洗3遍后，置于自来水中返蓝10 min。再将盖玻片放于伊红溶液中染色1 min，超纯水清洗3遍，晾干，中性树胶封片，用显微镜采集图片。

2.3.3 划痕实验观察肝癌细胞生长迁移 细胞接种到12孔板中后置于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，第2天当细胞汇合度达到80%～90%时，用无菌200 µL移液枪枪头尖端从左至右水平轻轻刮擦，经无菌PBS清洗后加入2 mL/孔的完全DMEM培养基，再置于显微镜下拍照。按“2.3.1”项下分组干预，每隔24 h拍照1次，直至对照组划痕全部闭合。

2.3.4 Hoechst染色法观察肝癌细胞凋亡情况 细胞按照1.0×105个/mL接种在6孔板后置于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，贴壁后按“2.3.1”项下分组干预24 h，弃去上清液，PBS洗2遍后用福尔马林进行固定，加入400 µL的10 µg/mL Hoechst 33342染色并避光，15 min后PBS洗3遍，用荧光显微镜拍照。

2.3.5 细胞迁移实验观察肝癌细胞迁移侵袭能力 取对数生长期细胞消化，使用无血清DMEM培养基重悬后稀释至所需细胞密度，24孔板下加入600 µL含10%FBS的DMEM培养基，并取等体积细胞悬液加入Transwell小室，按“2.3.1”项下分组干预，孵育24 h后取出小室用PBS清洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min后再用PBS清洗2遍，加入0.1%结晶紫染色30 min，最后用PBS清洗2遍并用棉签轻轻擦去表面未迁移细胞后，置于光学显微镜下拍照观察。

2.3.6 可见分光光度法检测肝癌细胞葡萄糖浓度 按“2.3.1”项下分组干预24 h，收集细胞到离心管内，离心后弃上清；按照一定比例加入蒸馏水后用超声波破碎细胞（冰浴，功率20%，超声3 s，间隔10 s，重复30次），放置于沸水浴中煮沸10 min，冷却后，25 ℃下8 500 r/min离心10 min，取上清液备用。分光光度计预热30 min，蒸馏水调零，按照葡萄糖含量检测试剂盒说明书，在样本中加入提前配置好的试剂混匀后，置于37 ℃水浴保温15 min，于505 nm波长处读取吸光值。

2.3.7 Agilent Seahorse XF能量代谢检测肝癌细胞能量代谢水平 按照XF ATP RATE ASSAY检测步骤说明书进行实验，按“2.3.1”项下分组干预后，利用Seahorse XFe9检测系统，检测三磷酸腺苷（ATP）水平。

2.3.8 Western blot法检测肝癌细胞GLUT1、MCT4、HK、PFK蛋白表达量 取对数生长期的肝癌细胞按照1×105个/mL的密度接种于6孔板中，当细胞汇合度达到50%～60%时，按“2.3.1”项下分组干预24 h。干预后提取蛋白，进行电泳、转膜、一抗冷库孵育过夜，TBST洗膜，二抗摇床孵育2 h，通过Bio-Rad成像系统对蛋白指标进行成像，并使用Image J软件对获得的蛋白数据分析整理。

2.3.9 荧光定量PCR法检测肝癌细胞HIF-1α、miR-210 mRNA表达水平 取对数生长期的细胞进行接板并置于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，待细胞贴壁后，按“2.3.1”项下分组干预24 h，收集肝癌细胞，按经典RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，并用常规逆转录方法将mRNA转录成cDNA，SYBR Green I做为荧光染料，而后根据Light CyelerDNA Master SYBR Green I说明书进行荧光定量PCR扩增。HIF-1α正引：GCAGCAACGACACA GAAACT，反引：TGCAGGGTCAGCACTACTTC；miR-210正引：AATAATCGCTGTGCGTGTGAC，反引：AG TGCAGGGTCCGAGGTATT。检测HIF-1α和miR-210 mRNA水平的表达。

2.4 统计学方法 采用SPSS 24.0软件包进行数据分析。计量资料符合正态分布以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Student-Newman-Keuls法。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 不同干预时间对低氧和常氧条件下肝癌细胞增殖活性的影响 MTT结果显示，在低氧条件下培养的3株肝癌细胞增殖活性较常氧条件下明显增强，并随着培养时间的增长而不断升高。其中，Huh7和HepG2肝癌细胞在低氧条件下24 h细胞增殖活性达到最高，Hep3B细胞增殖活性在24 h仍在缓慢上升，至36 h达到峰值。见图1。

图1 不同干预时间对低氧和常氧条件下肝癌细胞增殖活性的影响

3.2 不同干预时间对低氧和常氧条件下肝癌细胞HIF-1α蛋白表达的影响 Western blot结果显示，3株肝癌细胞在低氧条件下HIF-1α蛋白表达量较常氧条件下明显上调，且随着培养时间的延长蛋白表达量也逐渐升高，说明低氧细胞模型已成功建立。因此结合MTT实验结果，后续实验将选取低氧24 h为JXY干预时间点。见图2。

图2 不同干预时间对低氧和常氧条件下肝癌细胞HIF-1α蛋白表达的影响

3.3 不同浓度JXY和不同干预时间对低氧和常氧条件下肝癌细胞活力的影响 JXY干预后在低氧和常氧条件下均能抑制肝癌细胞增殖，其在低氧条件下的抑制效果显著高于常氧条件组，并且呈时间-剂量依赖性，见图3。

图3 不同浓度JXY和不同干预时间对低氧和常氧条件下肝癌细胞活力的影响

3.4 常氧和低氧条件下JXY对肝癌细胞形态的影响 细胞予以不同浓度JXY干预后置于不同条件下培养，结果发现在0 mg/mL浓度下，细胞在低氧条件下较常氧条件形态发生明显改变；而在相同条件下，高浓度JXY干预可明显抑制低氧条件导致的肝癌细胞的形态改变。见图4。

图4 4组肝癌细胞不同干预时间细胞爬片图（×200）

3.5 常氧和低氧条件下JXY对肝癌细胞转移能力的影响 划痕实验结果表明，予以0 mg/mL JXY浓度下的Hep3B细胞迁移能力在不同条件下无明显变化，HepG2和Huh7细胞在常氧条件下的迁移能力较低氧条件下更强；而高浓度能显著抑制2种条件下3株肝癌细胞的迁移能力。见图5。

图5 4组肝癌细胞划痕愈合图（×100）

3.6 低氧和常氧条件下不同浓度JXY对肝癌细胞凋亡能力的影响 选取0.1 mg/mL作为后续生物学机制研究的浓度，检测常氧和低氧条件细胞凋亡，染色结果表明，在低氧和常氧条件下JXY干预均能促进肝癌细胞凋亡，低氧条件下发生凋亡的细胞数量更多。见图6。

图6 4组不同肝癌细胞Hoechst染色图（×200）

3.7 常氧和低氧条件下JXY对肝癌细胞转移能力的影响 细胞迁移实验表明，高浓度JXY对肝癌细胞侵袭迁移能力具有显著抑制作用。见图7。

图7 4组肝癌细胞迁移作用图（×100）

3.8 4组肝癌细胞HIF-1α蛋白表达及HIF-1α、miR-210 mRNA表达水平比较 Western blot结果显示，在0 mg/mL JXY浓度下，2株肝癌细胞在低氧条件下产生的HIF-1α显著高于常氧条件组，而高浓度JXY能显著下调在不同条件下HIF-1α的蛋白表达，见图8。同时荧光定量PCR结果显示，在0 mg/mL JXY浓度下，低氧条件下HIF-1α的累积促进了miR-210 mRNA水平的表达，而高浓度JXY在抑制HIF-1α的同时也抑制了miR-210 mRNA水平的表达，两者呈正相关。见图9。

图8 4组肝癌细胞HIF-1α蛋白表达比较

图9 4组肝癌细胞HIF-1α和miR-210 mRNA表达水平比较

3.9 4组肝癌细胞葡萄糖含量和细胞能量代谢比较 葡萄糖含量检测实验和细胞能量代谢检测结果显示，在0 mg/mL JXY浓度下，低氧条件组较常氧条件组葡萄糖摄取含量和糖酵解途径的ATP产量增加；而JXY干预对其具有显著的抑制效果。见图10。

图10 4组肝癌细胞葡萄糖含量和细胞能量代谢比较

3.10 4组肝癌细胞GLUT-1、HK、PFK和MCT-4蛋白表达比较 Western blot结果表明，低氧条件下由于能量代谢重编程引起的GLUT-1、HK、PFK和MCT-4等相关蛋白的高表达，JXY干预后均能起到显著的抑制作用。见图11。

图11 4组肝癌细胞GLUT-1、HK、PFK和MCT-4蛋白表达比较

4 讨 论

肿瘤细胞为了适应在低氧环境下对能量的需求，会对能量进行代谢重编程，即弱化线粒体的氧化磷酸化途径，取而代之选择糖酵解，主要表现为葡萄糖摄取量显著提高、糖酵解活性明显增强及乳酸大量堆积，又被称为Warburg效应。肿瘤细胞代谢重编程的间接表现是葡萄糖摄取量增加，因为葡萄糖不能通过细胞膜，在很大程度上依赖于葡萄糖转运体的运输，肿瘤为摄取葡萄糖会应激性高表达GULT，其中GULT-1和GULT-3是HIF-1转录调节的靶基因，其转录水平表达升高与HIF-1直接相关。糖酵解过程中的3个限速酶HK、PFK和PK是糖酵解途径的3个关键调节点，其转录水平和激酶活性受HIF-1的直接调控［5］。而且糖酵解不仅可为细胞增殖提供不可缺少的中间代谢产物，如6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖、磷酸烯醇式丙酮酸及丙酮酸等，作为细胞合成核酸、氨基酸、脂肪酸等细胞结构生物大分子不可或缺的前体物质，又可快速产生一定量的ATP用于维持细胞能量稳态，使肿瘤细胞达到生长与代谢的空前平衡［13］，而此过程的调控核心单元为HIF-1/miR-210回路。

实体肿瘤组织内部处于低氧状态，这时细胞通常会通过启动相关信号调节通路，从而改变分子的DNA转录模式以应对不良微条件，应对这种改变的核心分子是HIF-1。HIF-1由对氧敏感的HIF-1α亚基和对氧不敏感的HIF-1β亚基组成，在正常氧分压下HIF-1β是具有活性的分子，而HIF-1α则通过PHD羟化其分子上的脯氨酸后进入蛋白酶体降解通路最终被酶解代谢［14-15］。在肿瘤低氧的微环境中，HIF-1α的降解途径被阻断，直接导致HIF-1α水平的累积。

人miR-210位于染色体1lp15.5，序列为“CUGU GCGUGUGACAGCGGCUGA”。常氧条件下，内源性miR-210水平维持在非常低的状态［16］。低氧条件下，HIF-1α的表达应激性上调，HIF-1α启动子区域的缺氧反应元件可和miR-210序列（6～8个核苷酸）配对，抑制miR-210降解的同时上调miR-210转录产物［17］，过表达miR-210又可削弱PHD mRNA的翻译水平，降低HIF-1α的羟化，抑制其降解。实验表明肿瘤细胞在缺氧处理48～72 h后，上调的HIF-1α能够促进VEGF和miR-210的表达，而抑制miR-210 mRNA水平则会降低HIF-1α的蛋白水平［18］。这表明HIF-1α与miR-210之间是一个正反馈回路的调控关系［19］。

研究表明夏枯草的主要成分夏枯草总黄酮可同时抑制线粒体氧化磷酸化和糖酵解途径抑制肝癌诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡，苦参素抑制HepG2细胞糖酵解过程抑制肝癌细胞增殖，此外红豆杉、白头翁、穿心莲、黄芩、半枝莲等多种清热解毒中药都具有抑制肿瘤糖酵解途径中关键酶的作用［20-22］。这为中药抗肿瘤药物研究提供了新的治疗靶点。而清热解毒中药通过HIF-1α/miR-210正反馈回路调控肿瘤细胞能量代谢重编程过程具体作用机制目前尚未见相关报道。

中医学认为癌症多为内虚邪扰，阴阳严重失调，瘀、毒、虚、六淫等诸多因素均与癌症相关。治疗上一般采取扶正祛邪，调理各脏腑机能，增强体质和免疫力。而解毒消癥饮入肝经，方中白花蛇舌草、夏枯草、山慈菇、苦参四药性味均属苦、甘、寒，是清热解毒法中药验方，可通过疏泄癌肿堵塞的肝经，化解日久化热所致小便短赤、大便干结、舌红苔厚等热证。

本研究通过建立低氧和常氧细胞模型，对比模拟肝癌细胞生长环境，证明低氧和常氧条件下肿瘤细胞能量代谢重编程的应答机制在形态及功能方面的显著差异，同时探讨JXY通过HIF-1/miR-210回路调控肝癌细胞能量代谢重编程的具体作用机制。结果显示肝癌细胞在低氧条件下的增殖活性较常氧条件下明显增强，并随着培养时间的增长而不断升高。其中，Huh7和HepG2肝癌细胞在低氧条件下24 h细胞增殖活性达到最高，Hep3B细胞增殖活性在24 h仍在缓慢上升，至36 h达到峰值。因此后续实验选取低氧24 h为JXY干预时间点。肝癌细胞在低氧条件下HIF-1α蛋白表达量较常氧条件下明显上调，且随着培养时间的延长蛋白表达量也逐渐升高。而在JXY干预后，其在低氧和常氧条件下均能抑制肝癌细胞增殖，且在低氧条件下的抑制效果显著高于常氧条件组，呈时间和剂量依赖性。同样地，JXY干预在低氧条件下促进肝癌细胞凋亡作用显著。低氧条件下JXY干预对肝癌细胞的形态学改变、侵袭迁移能力和能量代谢重编程过程中所需的葡萄糖摄取，以及相关因子HIF-1α、GLUT-1、HK、PFK和MCT-4蛋白表达量和HIF-1α调控的miR-210 mRNA表达水平均有显著的抑制作用。由此猜想，JXY可能通过抑制HIF-1/miR-210正反馈回路，抑制肿瘤细胞糖酵解过程，从而抑制糖酵解过程中所需葡萄糖摄取和ATP生成，进而抑制GLUT-1、HK、PFK、MCT-4的表达。最终调整整个能量代谢重编程过程，达到抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、转移等目的。