回顾性分析单核苷酸多态性微阵列分析技术在胎儿先天性心脏病诊断中的应用价值*

林 琴，黄秀琼，毛雅珍，沈玲英，刘欣茹

福建医科大学附属福州市第一医院：1.检验科；2.产科，福建福州 350000

先天性心脏病(CHD)是指胚胎时期心脏发育受环境、药物、宫内感染、基因突变或染色体异常等因素影响，引起胎儿心血管发育异常的一组疾病，根据《中国出生缺陷防治报告(2012)》显示，CHD的发病率在出生缺陷中排首位[1]。有研究表明，在产前诊断为CHD的胎儿中，染色体异常约占30%[2]。因此，产前筛查时对超声检查提示胎儿CHD的孕妇，建议经超声介导进行侵入性遗传学检测，这对了解CHD的遗传学病因具有重要的临床意义。染色体核型分析是目前最常用的产前细胞遗传学分析技术，也是产前细胞遗传学诊断的“金标准”，但该技术存在操作繁琐、细胞培养周期长、分辨率低(>10 Mb)等缺点。有研究表明，染色体拷贝数变异(CNV)所导致的微缺失或微重复综合征占染色体畸变所致出生缺陷的1/2[3]，与传统染色体核型分析技术相比，染色体微阵列分析技术能在全基因组水平检测不平衡CNV[4]，目前其主要分为单核苷酸多态性微阵列(SNP array)分析技术和微阵列比较基因组杂交(aCGH)分析技术，染色体微阵列分析技术具有高分辨率、高通量、周期短、不需要细胞培养，只需要少量DNA即可检测等优点，在不平衡CNV的检测方面弥补了染色体核型分析的不足，临床医生可根据CNV结果给孕妇提供合理的建议，因而染色体微阵列分析技术被广泛应用于产前遗传学诊断中。本研究对140例超声心动图提示胎儿CHD的孕妇进行羊水染色体核型分析和SNP array分析，以探讨SNP array分析技术在诊断胎儿CHD中的价值，为临床诊治提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年1月至2021年12月因超声心动图提示胎儿CHD就诊于本院遗传咨询门诊的妊娠18～25周孕妇140例，所有孕妇均行羊膜腔穿刺术采集标本，均进行染色体核型分析及SNP array分析。纳入标准：(1)超声心动图提示胎儿CHD，包括房/室间隔缺损、与心脏连接的血管结构异常、心脏瓣膜结构异常、大动脉转位、心脏位置异常、心脏肿瘤等;(2)单胎妊娠；(3)无放射性物质接触史、无宫内感染。排除标准:(1)家属或孕妇不同意参与本研究;(2)超声心动图提示胎儿心脏仅有软指标异常，包括心脏点状强回声、三尖瓣或二尖瓣反流、心律失常、心律不齐等。对符合上述标准的孕妇，由经验丰富的产前遗传咨询医生介绍两种细胞遗传学检测技术，包括技术的局限性及检测可能存在的风险等。所有研究对象及其家属均签署知情同意书，本研究经过本院医学伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1标本采集 超声心动图提示胎儿CHD的孕妇在妊娠18～25周由经验丰富的临床医生在超声介导下行无菌羊膜腔穿刺术，抽取羊水30 mL用于染色体核型分析和SNP array分析。

1.2.2染色体核型分析 将采集的羊水离心后，用贴壁细胞法培养获得羊水细胞制片，G显带后对中期分裂相染色体进行分析。

1.2.3SNP array分析 采用美国Affymetrix公司生产的CytoScan 750k芯片试剂盒，将标本DNA与高密度覆盖单核苷酸多态性(SNP)和CNV探针的基因芯片杂交，在全基因组水平进行检测，参考国际公共基因数据库及相应指南对结果进行判读。判读结果分为致病性CNV(pCNV)、良性CNV、临床意义不明确CNV(VOUS)。

1.3统计学处理 采用GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析。计数资料以例数或率表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1140例CHD胎儿超声心动图检查结果 在140例CHD胎儿中，孤立性心脏畸形66例(47.14%)，其中孤立性房/室间隔缺损36例(25.71%)，孤立性大动脉转位15例(10.71%)，孤立性瓣膜异常3例(2.14%)，孤立性永存左上腔静脉11例(7.86%)；多发性心脏畸形34例(24.29%)；合并心外畸形40例(28.57%，包括中枢神经系统、消化系统、泌尿系统畸形及鼻骨缺失、唇腭裂、四肢畸形、单脐静脉)；最常见的心脏畸形为室间隔缺损，有单独存在，也有合并心脏其他畸形或心外畸形存在，共检出79例(56.43%)。

2.2不同类型CHD胎儿SNP array分析和染色体核型分析检出的染色体异常结果比较 对140例超声心动图提示CHD的胎儿羊水均进行两种技术的检测，SNP array分析检出染色体异常20例(14.29%)，其中孤立性心脏畸形中有3例，多发性心脏畸形中有5例和合并心外畸形中有12例；染色体核型分析检出染色体异常9例(6.43%)，其中孤立性心脏畸形中有0例，多发性心脏畸形中有1例，合并心外畸形中有8例；两种检测技术染色体异常检出率比较差异有统计学意义(χ2=2.157，P<0.05)，见表1。SNP array分析在室间隔缺损胎儿中检出染色体异常14例。SNP array分析在未合并心外畸形胎儿中检出染色体异常占8.00%(8/100)，在合并心外畸形胎儿中检出染色体异常占30.00%(12/40)，差异有统计学意义(χ2=3.093，P<0.05)。超声心动图提示合并心外畸形胎儿中，两种检测技术均检出6例染色体非整倍体异常，含有1例13-三体，2例18-三体，3例21-三体。

2.3两种检测技术检出染色体异常结果的差异 140例CHD胎儿中，SNP array分析检出微缺失5例，微重复9例，嵌合体1例；而染色体核型分析检出嵌合体2例，微缺失1例，微重复1例，9号染色体臂间倒位4例。染色体核型分析漏检微缺失4例，微重复8例，均在染色体核型分析无法常规检测到的大小范围内；比较两种检测技术对微缺失和微重复的总检出率，差异有统计学意义(χ2=8.0211，P<0.05)。SNP array分析漏检9号染色体臂间倒位4例，低比例嵌合体1例(核型结果：45,X[6]/46,XX[75])。

2.4SNP array分析检出染色体异常中CNV结果 SNP array分析检出14例CNV，其中pCNV 3例，分别为3q29微缺失综合征、8p23.1缺失综合征、16p11.2缺失综合征各1例，有2例进行家系验证：1例来源于母亲，1例来源于新发突变；VOUS 11例，其中5例进行家系验证，4例来源于母亲，1例来源于父亲，见表2。

表1 不同类型CHD胎儿SNP array分析和染色体核型分析检出的染色体异常结果比较[%(n/n)]

表2 SNP array分析检出的CNV及胎儿表型

序号片段大小包含基因相关疾病CNV遗传性研究妊娠结局11.6MbDLG1、FBXO45、PAK2等17个OMIM基因3q29微缺失综合征母源性,母亲表型正常引产212.3MbCLN8、GATA4等42个OMIM基因8p23.1缺失综合征新发引产31.0MbTUFM、SH2B1等20个OMIM基因16p11.2缺失综合征未知引产41.4MbPMP22等5个OMIM基因不明确未知出生正常,早产51.7MbPLGLA、RGPD3等4个OMIM基因不明确母源性,母亲表型正常出生6个月死亡(原因不明)6560.6kbCNTN6不明确父源性,父亲表型正常出生正常71.4MbZFP42不明确未知CHD8512.3kbNIPA等4个OMIM基因不明确母源性,母亲表型正常引产91.8MbTRPM1、CHRNA7等7个OMIM基因不明确母源性,母亲表型正常引产10432.5kbCHRNA7不明确未知出生正常

续表2 SNP array分析检出的CNV及胎儿表型

3 讨 论

CHD是目前临床常见的出生缺陷疾病之一，随着外科技术的进步，大部分CHD患儿可通过手术获得良好的预后,但仍有一部分复杂的CHD胎儿由于本身的染色体异常，导致出生后可能同时合并发育迟缓、特殊面容、智力障碍、免疫力低下等问题，使得患儿无法得到有效治疗，给社会、家庭造成巨大的负担。故胎儿期筛查和诊断CHD不应只局限于超声影像学检查，还应进行遗传病因层面的检测和分析，从而更有利于对CHD患儿预后的判断及降低胎儿出生缺陷率。本研究通过对140例超声心动图提示为CHD的胎儿染色体核型分析和SNP array分析结果进行比较，探讨胎儿CHD与染色体异常，尤其是与不平衡CNV的关系，以及SNP array分析在CHD诊断中的应用价值。

室间隔缺损是最常见的CHD之一，本研究CHD中室间隔缺损共79例(56.43%)，在心脏畸形中排首位，同时在室间隔缺损胎儿中SNP array分析检出染色体异常14例(17.72%,14/79)。张璘等[5]报道室间隔缺损的胎儿染色体异常检出率为16.67%(10/60)，与本研究数据相近，可见室间隔缺损的胎儿染色体异常检出率较高。本研究通过SNP array分析发现，合并心外畸形的胎儿染色体异常检出率明显高于未合并心外畸形的胎儿(P<0.05)，与赵颖等[6]的报道结果一致。上述结果提示在产前超声心动图显示胎儿存在室间隔缺损时应重视遗传学病因分析结果，特别是提示合并多器官畸形时，需联合行SNP array分析，有助于查找胎儿发育畸形的根本原因。

本研究中，SNP array分析染色体异常的检出率为14.29%，染色体核型分析染色体异常检出率为6.43%，相较于传统染色体核型分析，SNP array分析能将染色体异常检出率提高7.86%。有研究显示，相较于染色体核型分析，SNP array分析将染色体异常检出率提高了5.26%[7]，本研究染色体异常检出率提高值略高于上述报道，可能是与入组的CHD类型不同、病例总数不同等有关。两种检测技术均检出相同的6例染色体非整倍体异常，1例嵌合体和1例微缺失，但SNP array分析对微缺失、微重复的总检出率明显高于染色体核型分析(P<0.05)，有4例微缺失和8例微重复被SNP array分析检出而染色体核型分析均未检出异常。与染色体核型分析相比，SNP array分析最大的优势在于其可检出>100 kb的不平衡CNV，因其高分辨率的特点，大大提高了染色体异常的检出率，因此近年来其成为产前遗传学诊断的主流技术。另外，本研究还发现4例9号染色体臂间倒位和1例低比例嵌合体，染色体核型分析检出而SNP array分析未提示异常，因SNP array的方法学特性,其无法检出染色体臂间倒位及小于25%的低比例嵌合体，因此在产前推荐使用两种技术联合检测，能有效提高染色体异常的检出率。

本研究共检出14例CNV，包括pCNV 3例，VOUS 11例。其中1例3q29微缺失属于明确的致病性CNV。3q29微缺失/微重复综合征是一种显性遗传的罕见病，DLG1、FBXO45、PAK2被认为是参与3q29微缺失综合征的候选基因[8]，该疾病在个体间可呈现多样的临床表型，累及各个器官、系统，最严重的表现是CHD，最常见的是胃肠道症状，多有神经、精神发育障碍，包括自闭症谱系障碍和精神分裂症等[9]。有研究报道，3q29微缺失综合征以室间隔缺损、唇腭裂等多发畸形为临床表型[10]。本研究中，经家系验证该片段的缺失来源于母亲。

8p23.1缺失片段中含有GATA4基因，GATA4是转录因子编码基因，其编码的蛋白在胚胎发育过程中心脏的发育中发挥重要的调节作用。已有研究报道，GATA4基因缺失会导致室间隔缺损及先天性膈疝，因此GATA4被认为是关键致病基因[11-12]；另一项关于CHD与8p23.1缺失相关性的研究发现，8p23.1缺失综合征临床表型以不同程度的CHD多见，主要有室间隔缺损、肺动脉闭锁、主动脉关闭不全、大动脉转位、持续性左上腔静脉等[13]，本研究与上述报道表型相符。除了发生CHD外，8p23.1缺失还可能引起面部畸形、多指、脑发育障碍、智力障碍等异常，8p23.1区域缺失片段的位置和大小、包含基因、遗传外显率等因素可能导致不同的临床表型，但目前尚不明确是与GATA4外显率有关还是存在其他的致病基因[14]。本研究该例8p23.1缺失综合征胎儿经家系验证，父母均正常，考虑该染色体异常可能来源于新发突变。

据报道，16p11.2缺失综合征的临床表型存在异质性，16p11.2遗传位点的CNV与神经发育障碍高度相关，主要表现为自闭症、癫痫、智力障碍[15]；另有研究报道，涉及SH2B1基因的16p11.2缺失综合征也与严重的早期肥胖和糖尿病有关[16]。本研究16p11.2缺失综合征表现为室间隔缺损等心脏异常、双侧脑室重度积水、单脐动脉，与LI等[17]的研究结果一致。

本研究共检出11例VOUS,其中1例为17p12缺失，内含PMP22等5个OMIM基因，PMP22基因的突变与遗传性周围神经疾病和遗传性神经病变伴压力性麻痹有关[18]。PMP22基因是一种剂量敏感基因。剂量敏感基因可能与其他基因(例如蛋白质合成基因)以浓度依赖的方式相互作用，可能产生高浓度下易于聚集的蛋白质(例如SNCA28)，或者可能具有实现功能所需的最低浓度(即单倍体不足基因，包括许多转录因子和发育基因)[19]。当这些基因的剂量被重叠的CNV改变时，基因的功能会被破坏，从而引起疾病。目前，含有PMP22基因的17p12片段缺失以CHD为临床表型的相关报道少见,因此17p12缺失与CHD的相关性还有待研究。

本研究中3例检测出pCNV的孕妇选择引产。相对于参考基因组，每个个体平均有1 000个>450 bp的CNV[20]。基因组中的一些区域是CNV好发区域，约10%的人类基因组经历了反复的CNV[21]，这种变异通常不会产生表型，因为CNV通常是小的、发生在基因间的或包含可以耐受拷贝数变化的基因，有些基因甚至可以被完全删除而没有明显的表型[22]，故当SNP array分析结果为VOUS时，临床医生需进一步通过家系验证来判断其来源，并且结合父母的表型给予更准确合理的遗传咨询。本研究11例VOUS中，有5例进行家系验证，其中4例来源于母亲(妊娠结局：2例引产，1例出生6个月死亡，1例出生正常)，1例来源于父亲(妊娠结局：出生正常)，其余6例拒绝进一步验证(妊娠结局：1例引产，1例发生CHD，3例出生正常，1例失访)。

本研究的不足之处：由于本研究为回顾性研究，并非所有的VOUS病例均进行了夫妇验证，且5例明确遗传来源的病例中有2例还是选择引产，这种病例是遗传咨询的难点，遗传咨询医生应通过查找数据库及文献，对VOUS的检测结果进行判读和解释，在孕妇和家属充分理解的基础上，尽量减少非必要的引产。

综上所述，SNP array分析技术比传统染色体核型分析具有更高的分辨率，能更准确地筛查出CNV，提高染色体异常的检出率，为临床医生的诊断提供更多的遗传学依据。但该技术也有一定的局限性，可能会漏检染色体平衡性结构重排(如易位、倒位、插入)、低比例嵌合体，另外，对于SNP array分析结果为VOUS者，增加了临床医生遗传咨询的难度，也给患者带来了困扰。因此，本研究认为，染色体核型分析联合SNP array分析技术在胎儿CHD诊断中更有利于正确评估胎儿预后，在产前遗传咨询中尤为重要。