抗核抗体荧光核型在原发性胆汁性胆管炎和自身免疫性肝炎筛查中的作用评估*

王之青，郑冰（上海交通大学医学院附属仁济医院检验科，上海200127）

抗核抗体（antinuclear antibodies，ANA），又称抗细胞抗体（anti-cellular antibody，AC），是包括针对真核细胞内各种抗原成分的自身抗体总称，其对自身免疫病具有较高的诊断敏感性。人喉鳞状细胞癌细胞系Hep-2（Human epithelial type 2）细胞含有数百种天然抗原，以Hep-2细胞为底物的间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence assay，IFA）可检测患者血清中不同自身抗体，并呈现相应的荧光核型［1］。国际抗核抗体荧光核型共识（international consensus on ANA patterns，ICAP）目前定义并命名了30种荧光核型，每种核型名称以AC（anticell）开头（AC-0～AC-29），并在ICAP网站（www.ANApatterns.org）归纳了不同荧光核型所对应的临床意义［2］。该工作对于阐述ANA荧光核型的免疫学相关性和优化IFA检测在患者疾病诊断中的应

用具有重要意义。本研究通过分析原发性胆汁性胆管炎（primary biliary cirrhosis，PBC）和自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）患者ANA荧光核型的检出情况，评估HEp-2 IFA在PBC和AIH患者疾病筛查中的意义及相关核型与特异性自身抗体检出率的相关性。

1 材料和方法

1.1 研究对象 选取上海交通大学医学院附属仁济医院2019年4—12月进行自身免疫性肝病（autoimmune liver disease，ALD）筛查试验并明确诊断为PBC和AIH的患者，排除临床信息不全的样本。PBC和AIH的诊断依据分别为2017年欧洲肝病学会临床实践指南［3］和2015年我国AIH诊断和治疗共识［4］。PBC患者106例，年龄（53.3±11.4）岁，其中女性92例（86.8%），男性14例（13.2%）；AIH患者138例，年龄（52.1±12.8）岁，其中女性120例（87.0%），男性18例（13.0%）。

1.2 试剂与仪器 自身抗体谱IgG检测试剂盒（IFA）、ALD IgG类抗体检测试剂盒（免疫印迹法，德国欧蒙公司），抗肌动蛋白IgG抗体检测试剂盒（酶联免疫法，美国INOVA公司）；Sprinter-XL全自动分析仪、EUROLineMaster Plus-A全自动免疫印迹仪（德国欧蒙公司）。

1.3 方法 用IFA法检测血清ANA、抗线粒体抗体（anti-mitochondrial antibody，AMA）和抗平滑肌抗体（anti-smooth muscle antibody，ASMA），用自身抗体谱IgG检测试剂盒在Sprinter-XL全自动分析仪上进行检测。按试剂说明书，滴度≥1∶100判为阳性。ANA荧光核型判读依据ICAP所定义的30种荧光核型（AC-0～AC-29）。

用免疫印迹法检测ALD相关特异性抗体，采用ALD IgG类抗体检测试剂盒在全自动免疫印迹仪EUROLineMaster Plus-A进行检测和结果判读。特异性抗体谱包括：线粒体抗体M2亚型（AMA-M2）、肝溶质抗原1型（LC-1）抗体、肝肾微粒体抗体（LKM-1）、2－丙酮酸脱氢酶（M2-3E）抗体、早幼粒细胞白血病蛋白（PML）抗体、Ro52抗体、可溶性肝抗原／肝胰抗原（SLA／LP）抗体、斑点蛋白（Sp100）抗体和糖蛋白210（gp210）抗体，结果判定依据试剂说明书。

用酶联免疫法检测抗F-肌动蛋白抗体，用抗肌动蛋白IgG抗体检测试剂盒在Sprinter-XL全自动分析仪上进行检测。结果判定依据试剂说明书。

1.4 统计学分析 用SPSS 22.0、GraphPad Prism 5.01软件进行。计数数据用例数（n）、百分率（%）进行描述，皮尔森卡方检验或Fisher确切概率法分析；正态分布计量数据用均数±标准差（¯±s）表示，用t检验分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ANA检出率及主要核型分析 PBC和AIH患者ANA检出率分别为91.5%（97／106）和68.8%（95／138）。PBC患 者 中 单 一 核 型 占37.7%（40／106），混合核型占53.8%（57／106）。单一核型中，检出率前三位是胞浆网状／线粒体样型（AC-21）［13.2%（14／106）］、粗颗粒型（AC-5）［4.7%（5／106）］以及均质型（AC-1）、细颗粒型（AC-4）、点 状 核 膜 型（AC-12）［均 为3.8%（4／106）］；混合核型检出率最高的为着丝点型（AC-3）合并AC-21［13.2%（14／106）］。

AIH患者中单一核型占43.5%（60／138），混合核型占25.4%（35／138）。单一核型中，检出率最高的是细颗粒型（AC-4）［14.5%（20／138）］；混合核型检出率最高的为AC-12合并AC-21［8.0%（11／138）］。

PBC和AIH患者不同单一核型中的检出率见表1。荧光核型在PBC和AIH患者中检出率（包括在单一核型和复合核型中出现情况）见图1。

图1 不同荧光核型在106例PBC和138例AIH患者中的检出率

表1 不同荧光核型在PBC和AIH患者中分布

2.2 胞浆网状／线粒体样型和胞浆颗粒型与AMA 用106例PBC患者中，以鼠肾为基质的IFA法检测AMA的检出率为61.3%（65／106），而以HEp-2为基质的IFA荧光核型表现为胞浆网状／线粒体样型（AC-21）的检出率为50.9%（54／106），两者检出率差异无统计学意义（P＞0.05）。IFA荧光核型判读为AC-21的样本中AMA（IFA法）检出率为90.7%（49／54），其中滴度1∶100、1∶320和1∶1 000分别为18.5%（10／54）、40.7%（22／54）和31.5%（17／54）。LIA法检测AMA-M2与抗M2-3E抗体在AC-21核型中检出率分别为87.0%（47／54）和94.4%（51／54）。AC-21核型中，AMA（IFA法）、AMA-M2和抗M2-3E抗体均阴性样本占1.9%（3／54）。

其他胞浆颗粒型荧光核型，包括胞浆散点型（AC-18）、胞浆致密颗粒型（AC-19）和胞浆细颗粒型（AC-20），AMA（IFA法）检出率分别为0、100.0%（2／2）和25.0%（1／4）。AMA-M2（LIA法）在AC-18、AC-19和AC-20荧光核型中检出率分别为0、50.0%（1／2）和25.0%（1／4）；抗M2-3E抗体（LIA法）在上述3种核型中检出率分别为0、100.0%（2／2）和25.0%（1／4）。

除AC-21核型以及3种胞浆颗粒型荧光核型以外，其他荧光核型和ANA阴性（AC-0）样本AMA（IFA法）检出率分别为36.8%（14／38）和0；AMA-M2（LIA法）检出率分别为15.8%（6／38）和11.1%（1／9）；抗M2-3E抗体（LIA法）检出率分别为34.2%（13／38）和0。AMA在上述各种ANA核型中检出率结果见表2。

表2 PBC患者中AMA在AC-21荧光核型与其他核型中的检出率分布

138例AIH患者中，AMA（IFA法）检出率为19.6%（27／138），而荧光核型表现为AC-21的检出率为50.9%（25／138），两者检出率差异无统计学意义（P＝0.758）。荧光核型判读为AC-21的样本中AMA（IFA法）检出率为88.0%（22／25），其中滴度1∶100、1∶320和1∶1 000分别为12.0%（3／25）、44.0%（8／25）和32.0%（8／25）。LIA法 检 测AMA-M2与抗M2-3E抗体在AC-21核型样本中检出率分 别为72.0%（18／25）和88%（22／25）。AC-21核型中，AMA（IFA法）、AMA-M2和M2-3E均阴性样本占12%（3／25）。

其他胞浆颗粒型荧光核型（AC-18、AC-19和AC-20），AMA（IFA法）检出率分别为100.0%（1／1）、25.0%（1／4）和20.0%（1／5）。AMA-M2（LIA法）在AC-18、AC-19和AC-20荧光核型中检出率分别为0、25.0%（1／4）和40.0%（2／5）；抗M2-3E抗体（LIA法）在上述3种核型中检出率分别为100.0%（1／1）、0和33.3%（2／5）。

除AC-21以及3种胞浆颗粒型荧光核型以外，其他荧光核型和ANA阴性（AC-0）样本，AMA（IFA法）检出率分别为3.3%（2／60）和0；AMA-M2（LIA法）检出率分别为3.3%（2／60）和0；抗M2-3E抗体（LIA法）检出率分别为3.3%（2／60）和0。抗线粒体抗体在上述各种ANA核型中检出率结果见表3。

表3 AIH患者中AMA在AC-21荧光核型与其他核型检出率分布

2.3 核点型与抗Sp100和抗PML抗体 106例PBC患者中，10.4%（11／106）ANA荧光核型为核多点型（AC-6），3.8%（4／106）为核少点型（AC-7）。抗Sp100抗体和抗PML抗体在AC-6检出率均明显高于AC-7以及除AC-6和AC-7以外的其他ANA核型。138例AIH患者中，1.4%（2／138）ANA荧光核型为核多点型（AC-6），0.7%（1／138）为核少点型（AC-7）。抗Sp100抗体在AC-6检出率均明显高于AC-7以及除AC-6和AC-7以外的其他ANA核型。见表4。

表4 PBC患者中抗Sp100抗体和抗PML抗体在AC-6荧光核型与其他核型检出率分布

2.4 点状核膜型与抗gp210抗体 106例PBC患者中，24.5%（26／106）ANA荧光核型为点状核膜型（AC-12），光滑核膜型（AC-11）未检出。抗gp210抗体在AC-12检出率明显高于其他ANA核型。138例AIH患者中，16.0%（17／106）ANA荧光核型为点状核膜型（AC-12），光滑核膜型（AC-11）未检出。抗gp210抗体在AC-12检出率明显高于AC-11及除AC-11和AC-12以外其他ANA核型。见表5。

表5 PBC患者中抗gp210抗体在AC-12荧光核型与其他核型检出率分布

2.5 胞浆纤维型与ASMA和抗F－肌动蛋白抗体 106例PBC患者中，未检出胞浆线性／肌动蛋白型（AC-15）荧光核型。138例AIH患者中，1.5%（2／138）ANA荧光核型为胞浆线性／肌动蛋白型（AC-15），0.7%（1／138）为 胞 浆 丝 状／微 管 型（AC-16），胞浆节段型（AC-17）未检出。ASMA和抗F－肌动蛋白在AC-15中的检出率明显高于AC-16和除AC-15、16和17以外的其他核型。见表6。

表6 AIH患者中ASMA和抗F－肌动蛋白抗体在AC-15荧光核型与其他核型检出率分布

3 讨论

IFA法检测抗核抗体对自身免疫病筛查具有重要作用，其检测结果中包括抗体滴度和荧光核型。其中，抗体滴度与患者体内ANA含量呈一定相关性，虽然一般人群中也存在低滴度ANA［5］，但系统性自身免疫病患者体内一般为中、高滴度抗体；而荧光核型则与特定样本中所含的特异性自身抗体有关，有助于自身免疫病的诊断与鉴别诊断。ICAP目前共定义了30种荧光核型，且依据判读的难易程度将30种核型分为必报核型和选报核型［2］。而2018年由中国医师协会风湿免疫科医师分会自身抗体检测专业委员会发布的《抗核抗体检测的临床应用专家共识》［6］中明确指出，由于ALD在我国发病率较高，建议将ICAP所规定核膜型（AC-11／12）和胞浆线性／肌动蛋白型（AC-15）荧光核型，由选报核型变为必报核型。因此，本研究通过分析PBC和AIH患者中ANA荧光核型和特异性自身抗体检测的相关性，评估荧光核型在ALD筛查中的作用。

本研究中，PBC患者ANA检出率91.5%，且阳性样本中大部分为混合核型，而AIH患者ANA检出率仅68.8%，阳性样本中以单一核型为主。Wei等［7］对中国137名PBC患者和57名AIH患者进行ANA荧光核型分析，其中PBC患者混合核型占33.6%，而AIH患者混合核型仅3.5%，与本研究结果相似。另外，AC-21核型是PBC患者中最常见的ANA核型，且在AIH患者中也有18.1%的检出率，而其他胞浆颗粒型（包括AC-18／19／20）检出率仅0～3.8%。在PBC患者中AC-21荧光核型血清中AMA（IFA法）、AMA-M2和M2-3E检出率分别为90.7%、87.0%和94.4%，明显高于胞浆颗粒型AMA检出率（25.0%）和其他荧光核型（除外AC-18／19／20／21）AMA检出率（15.8%～36.8%）。因此，实验室对AC-21核型的准确判读，对后续进行AMA抗体检测具有重要提示作用。临床实验室应将该核型作为实验室必报荧光核型，并与其他胞浆颗粒型（包括AC-18／19／20）进行区分。

核膜型在ICAP定义中分为光滑核膜型（AC-11）和点状核膜型（AC-12），两者对应靶抗原不同。前者主要靶抗原为核纤层蛋白，临床尚无商品化检测试剂盒，可于健康人中检出且无疾病特异性［2］；后者主要靶抗原为抗核孔复合体抗体，如gp210、nup62和Tpr，其中抗gp210抗体是PBC患者特异性诊断标志，可在9.4%～41.2%的PBC患者中检出，而健康人群和其他疾病人群中检出率仅0～0.4%［8］。本研究中，AC-12在PBC患者中检出率24.5%，位居第二，且未检出光滑核膜型（AC-11）；PBC患者中AC-12样本抗gp210抗体检出率高达95.2%，而非核膜型抗gp210抗体检出率仅21.1%。因此，准确识别AC-12核型，对于后续PBC相关抗体检测具有重要意义。但由于HEp-2间期细胞核通常呈细颗粒样染色，AC-12易误判为核颗粒型；另外胞浆网状／线粒体样型荧光核型也会对核膜型的判读造成干扰。此时，以猴肝细胞为基质的荧光片可以辅助判读，通常情况下核膜型可在猴肝细胞核外圈有明显核膜染色。

核多点型（AC-6）对应的靶抗原主要为Sp100和PML，两者常共同检出于PBC患者；核少点型（AC-7）对应的靶抗原主要为p80－螺旋蛋白，其对于对任何疾病的阳性预测值都较低［2］。本研究中，AC-6在PBC患者中检出率为10.4%，位居第五，且AC-6阳性样本中抗Sp100抗体检出率为90.9%，而AC-7中该抗体检出率仅25.0%。抗Sp100抗体对PBC诊断敏感性虽较低（20%～40%），但特异性高（＞95%）［9］，并且在AMA阴性PBC患者的诊断具有重要价值［10］。因此，临床实验室判读核点型时，区分核多点与核少点对于ALD筛查具有重要意义。

本研究中，PBC患者中并未检出AC-15，而AIH患者中AC-15检出率仅1.5%。2例AC-15样本中，1例ASMA阳性，2例抗F－肌动蛋白抗体均阳性，因此AC-15核型对ASMA有一定相关性。临床实验室对ALD筛查人群进行ANA核型判读时，尤其需重视胞浆网状／线粒体样型、点状核膜型、核多点型和胞浆线性／肌动蛋白型荧光核型，并在报告中给予必要的临床建议。