激活蛋白-1家族成员JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun在初诊多发性骨髓瘤中的表达及临床意义*

燕法红,邱志远,李乾鹏,高伟杰,曹荣旋,王宝宏△

1.潍坊医学院第一附属医院/潍坊市人民医院血液内科，山东潍坊 261041；2.潍坊医学院，山东潍坊 261053

多发性骨髓瘤(MM)是一种克隆性浆细胞异常增殖的恶性疾病，约占造血系统疾病的10%，也是血液系统第2常见的恶性肿瘤[1]。近些年来，随着蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂、单克隆抗体等新的MM治疗药物不断涌现及造血干细胞移植的进一步应用，MM患者的预后得到了明显改善，但目前其仍然是一种不可治愈的疾病。进一步研究其发病机制并探索有效的治疗药物是临床亟待解决的难题。转录是DNA通过RNA聚合酶将遗传信息复制给RNA的过程，是基因表达的第一步。转录过程异常在MM的发生、发展中起到重要作用，其可干扰活化的B细胞向浆细胞正常分化，影响免疫球蛋白生成及骨髓微环境信号传导，导致MM的发生并推动其进展。在转录过程中，转录因子(TF)是一种非常重要的因子，只有当TF结合在其识别的DNA序列上后才能启动转录。激活蛋白-1(AP-1)是一类重要的TF，通常由Jun蛋白家族(c-Jun、JunB和JunD)、Fos蛋白家族(c-Fos、FosB、Fra-1和Fra-2)、ATF蛋白家族(ATF2、ATF3/LRF1、B-ATF、JDP1、JDP2)和Maf蛋白家族(c-Maf、MafA、MafB、MafF/G/K和Nrl)蛋白亚基中的亮氨酸拉链区域形成同源或异源二聚体，与DNA靶序列结合，调控靶基因表达[2]。组成成分不同的AP-1二聚体对反应元件亲和性不同，其中Jun-Fos异源二聚体 DNA 结合活性最高、最稳定，也是人类细胞中AP-1存在的主要形式。作为基因转录调控的分子开关，AP-1参与细胞的增殖、分化、凋亡、转化、迁移等多种过程，在肿瘤的发生、发展及炎症反应中发挥重要作用[3-10]。作为TF，AP-1家族在MM的病理生理过程中起到了很大作用，随着对其研究的不断深入，AP-1家族成员近年来逐渐成为被广泛开发的治疗新靶点，有望开辟MM治疗的新领域。

MM患者临床指标的变化包括血红蛋白(Hb)、清蛋白(ALB)水平降低，血清β2-微球蛋白(β2-MG)、球蛋白(GLO)、血肌酐(Scr)、血钙水平升高，骨髓中异常浆细胞比例增高等，这些指标的水平变化与患者的病情严重程度、分期、预后及治疗方案的选择等均有关。关于AP-1家族成员与这些临床指标之间的关系，相关报道较少。本研究探讨了初诊MM患者JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表达水平与上述临床指标水平间的相关性，并了解其与患者病情严重程度和预后的关系，旨在明确其临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年11月至2022年2月潍坊医学院第一附属医院血液内科收治的40例初诊MM患者作为研究对象，其中男23例，女17例；年龄39～83岁，平均(64.90±9.35)岁；国际分期系统(ISS)分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期13例，Ⅲ期22例。MM诊断与分期标准参照《中国多发性骨髓瘤诊治指南(2020年修订)》[1]。本研究经医院医学伦理委员会审核批准。

1.2试剂与仪器 PrimeScript RT Master Mix反转录试剂盒、TB Green Premix Ex Taq荧光定量试剂盒均购自日本TaKaRa公司，Trizol试剂购自杭州艾科瑞生物科技有限公司，红细胞裂解液购自北京索莱宝科技有限公司，磷酸盐缓冲液(PBS)购自天津灏洋华科生物科技有限公司。实时荧光定量PCR引物由华大基因科技股份有限公司合成。Light Cycler480荧光定量 PCR 仪购自瑞士罗氏公司。

1.3方法

1.3.1骨髓有核细胞提取与冻存 MM患者行常规骨髓穿刺，抽取骨髓液2 mL，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，加入红细胞裂解液，室温下静置10 min，300×g离心10 min，PBS洗涤2次，弃上清液，细胞沉淀中加入Trizol试剂，置于-80 ℃冰箱冻存备用。

1.3.2实时荧光定量PCR检测JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表达水平 提取总RNA，按照PrimeScript RT Master Mix反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 保存。然后进行PCR，按照TB Green Premix Ex Taq荧光定量试剂盒说明书操作，反应条件：变性95 ℃ 30 s，1个循环；PCR 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环；融解95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃，1个循环；降温50 ℃ 30 s，1个循环。JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun及内参β-actin的引物序列见表1。根据2-ΔΔCt法计算JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA的表达水平。

1.3.3临床指标收集 收集MM患者的临床指标，包括年龄、血清β2-MG、Hb、GLO、ALB、Scr、血钙、骨髓浆细胞比例。

表1 引物序列

2 结 果

2.1MM患者临床指标水平 纳入的MM患者Hb(90.95±28.92)g/L，GLO(52.05±26.20)g/L，ALB(35.06±8.55)g/L，血清β2-MG 5.65(4.20,9.12)mg/L,Scr 78.50(60.50,175.00)μmol/L,血钙(2.50±0.51)mmol/L，骨髓浆细胞比例(37.70±22.03)%。

2.2不同性别MM患者JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表达水平比较 不同性别MM患者JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.3不同ISS分期MM患者JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表达水平比较 ISS分期为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的患者JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

表2 不同性别MM患者JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表达水平比较或M(P25,P75)]

表3 不同ISS分期MM患者JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表达水平比较或M(P25,P75)]

2.4MM患者JunB mRNA表达水平与临床指标水平间的相关性 MM患者JunB mRNA表达水平与GLO水平呈正相关(r=0.320,P=0.044)，与其余指标水平无相关性(P>0.05)，见表4。

表4 MM患者JunB mRNA表达水平与临床指标水平间的相关性

2.5MM患者c-Maf mRNA表达水平与临床指标水平间的相关性 MM患者c-Maf mRNA表达水平与GLO水平呈正相关(r=0.350,P=0.027)，与ALB水平呈负相关(r=-0.316,P=0.047)，与其余指标水平无相关性(P>0.05)，见表5。

表5 MM患者c-Maf mRNA表达水平与临床指标水平间的相关性

2.6MM患者c-Fos mRNA表达水平与临床指标水平间的相关性 MM患者c-Fos mRNA表达水平与血钙水平呈正相关(r=0.317,P=0.046)，与其余指标水平无相关性(P>0.05)，见表6。

表6 MM患者c-Fos mRNA表达水平与临床指标水平间的相关性

2.7MM患者c-Jun mRNA表达水平与临床指标水平间的相关性 MM患者c-Jun mRNA表达水平与各项临床指标水平均无相关性(P>0.05)，见表7。

表7 MM患者c-Jun mRNA表达水平与临床指标水平间的相关性

3 讨 论

AP-1功能异常与淋巴瘤、MM等血液系统肿瘤关系密切。在淋巴瘤中，AP-1在经典型霍奇金淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤、原发性皮肤淋巴瘤等多种亚型中表达异常[11-12]。在MM中，AP-1不同亚家族蛋白在MM发生的不同环节中扮演不同的角色。MM的发生涉及B细胞向浆细胞分化、免疫球蛋白的产生与分泌、血管新生、骨病发生、骨髓微环境调节等。Fra-1可抑制B细胞转化为浆细胞，抑制免疫球蛋白生成[13]；Fra-2在多个不同阶段促进B细胞增殖与分化；B-ATF与B细胞的活化、生发中心形成、免疫球蛋白类别转换有关；c-Maf、MafB可促进MM细胞的增殖、迁移、侵袭、黏附，以及与骨髓基质细胞的相互作用，并诱导对硼替佐米及卡非佐米耐药；c-Jun抑制MM细胞增殖并诱导其凋亡；JunB促进MM细胞增殖，诱导MM细胞对激素与硼替佐米耐药，并促进血管新生。此外，c-Fos、Fra-1、Fra-2、JunB都可影响成骨细胞或破骨细胞的功能，与MM骨病的发生密切相关[14-16]。除MM与淋巴瘤外，AP-1在急性髓系白血病中亦可见异常表达[17]。鉴于AP-1在MM发病及进展中的作用，近年来以AP-1作为治疗靶点的药物不断被研发，个别药物已进入临床试验阶段，这些药物可通过抑制AP-1的表达、诱导AP-1降解、干扰AP-1蛋白之间的相互作用、干扰AP-1与DNA结合，以及表观遗传学层面调控等机制起到抗肿瘤作用[6-7,18-21]。

FAN等[10]研究了AP-1家族中最常见的成员(JunB、c-Jun、JunD、c-Fos、c-Maf)在MM中的作用，发现JunB作用最突出,将MM细胞与骨髓基质细胞共培育，JunB在mRNA与蛋白质水平均明显上调，且JunB与其靶点的结合能力明显强于其他AP-1家族成员；骨髓微环境中的生长因子，特别是白细胞介素-6，可上调MM细胞中JunB的表达；JunB表达敲低后，MM细胞的生长明显被抑制，凋亡通路失调，磷脂酰肌醇-3激酶、核因子-κB(NF-κB)、Janus激酶/信号转导及转录激活子、丝裂原活化蛋白激酶等重要信号通路失调，其他受到调控的生物学过程或分子包括DNA复制、代谢、细胞周期、细胞表面分子、细胞因子、生长因子等。在激素耐药MM细胞株中，JunB的表达水平高于激素敏感MM细胞株；激素耐药MM细胞株在敲低JunB的表达后可恢复对激素的敏感性，细胞增殖与存活被抑制[10]。在MM细胞株中诱导JunB表达能使细胞产生对硼替佐米的抵抗，有助于细胞存活；同时在正常浆细胞、意义未明单克隆免疫球蛋白血症、冒烟型MM、MM等不同阶段的浆细胞疾病患者中发现，经诱导后JunB mRNA表达水平逐级升高[10]。在MM的血管新生过程中，JunB也起到关键作用，其可提高血管内皮生长因子(VEGF)-A、VEGF-B、胰岛素样生长因子-1等促血管生长因子的表达，促进MM血管新生，加速MM进展[14]。此外，JunB的异常表达也可通过影响成骨细胞与破骨细胞的数量与功能参与MM骨病的发生[16]。由于按照Durie-Salmon分期，本研究中绝大部分患者为Ⅲ期，因此未分析JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表达水平与Durie-Salmon分期之间的相关性。本研究发现，MM患者JunB mRNA表达水平与GLO水平呈正相关(r=0.320,P=0.044)，考虑JunB与浆细胞分泌GLO的能力有关。

c-Maf作为原癌基因，在MM细胞中表达上调，可促进MM细胞的增殖、迁移、侵袭以及与骨髓基质细胞的黏附，并诱导对硼替佐米耐药，同时其还可通过增加VEGF的产生促进血管生成。10%～15%的MM患者出现t(14:16)染色体易位，可累及16q23区域的c-Maf，使c-Maf蛋白呈高表达。本研究中，MM患者c-Maf mRNA表达水平与GLO水平呈正相关(r=0.350,P=0.027)，与ALB水平呈负相关(r=-0.316,P=0.047)。尽管ALB是判断MM分期的核心指标，GLO水平的高低可反映浆细胞分泌单克隆免疫球蛋白的能力，但本研究未发现c-Maf mRNA表达水平与患者ISS分期有关[不同ISS分期患者c-Maf mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)]，考虑与本研究纳入的MM患者集中分布在ISS Ⅱ、Ⅲ期，而ISSⅠ期患者数量较少，可能导致结果偏倚，尚有待进一步扩大样本量并分析Durie-Salmon分期与AP-1家族成员表达水平的相关性，以明确AP-1是否与MM患者的病情严重程度及预后有关。

c-Fos在MM的骨病发生过程中发挥重要作用。c-Fos对破骨细胞的分化具有重要的调控作用。破骨细胞前体细胞表面的NF-κB受体活化因子与其位于成骨细胞的配体结合，募集肿瘤坏死因子受体相关因子，通过c-Jun氨基端激酶途径诱导c-Jun/Fos活化，调节c-Fos的表达，促进破骨细胞前体分化；同时还能通过NF-κB、蛋白激酶B途径使c-Fos表达增加，c-Fos与活化的T细胞核因子c1结合，启动破骨细胞特异性基因转录，诱导破骨细胞前体分化为成熟破骨细胞[22]。过表达c-Fos可促进破骨细胞分化，而抑制c-Fos表达则会抑制破骨细胞分化[23]。c-Fos表达上调后可导致破骨细胞活性增加，骨吸收加强，血钙水平升高。本研究中，MM患者c-Fos mRNA表达水平与血钙水平呈正相关(r=0.317,P=0.046),提示MM患者随着c-Fos mRNA表达水平升高，血钙水平亦升高，说明c-Fos与溶骨程度相关，与上述研究结果相符。

c-Jun作为原癌基因，在多种实体肿瘤中被发现表达上调[7]，然而在对MM的相关研究中发现，其起到抑制MM的作用，MM患者比健康者c-Jun/Fos活性降低；MM患者中，c-Jun低表达水平者比高表达水平者预后更差；诱导c-Jun表达可抑制MM细胞增殖并诱导其凋亡，因此，c-Jun对肿瘤可能起到双向作用[16]。本研究未发现MM患者c-Jun mRNA表达水平与临床指标水平存在相关性，考虑可能与其作用的不确定性有关，c-Jun mRNA表达水平与临床指标的关系有待进一步深入挖掘。

综上所述，AP-1家族成员JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表达水平与MM患者性别、ISS分期无明显关系；而JunB、c-Maf mRNA表达水平与患者蛋白合成能力相关，c-Fos mRNA表达水平与患者溶骨程度相关，JunB、c-Fos、c-Maf在MM的发病及疾病进展中可能发挥了一定作用，有望为今后MM的相关研究提供一定理论基础。