基于PiggyBac转座系统构建稳定表达ABEmax基因的HEK293T细胞系

张 璐 安莉莎 金孝华 马旭*

1.国家卫生健康委科学技术研究所(北京，100081)；2.国家人类遗传资源中心

PiggyBac(PB)是一种来源于昆虫鳞翅目的DNA转座子，遵循“剪切-粘贴”的转座机制，携带外源基因整合进宿主的基因组中稳定表达，并可以在多种生物中实现高效转座。PB系统因其操作简单、转座活性高等特征在基因组研究、干细胞相关研究和基因治疗等领域得到了广泛的研究和应用[1]。腺嘌呤碱基编辑器(ABE)通过将人工定向进化的腺嘌呤脱氨酶与部分结构域失活的nCas9(D10A)结合，实现对基因的靶位点进行精准的碱基编辑，最终可以实现A·T→G·C的碱基替换[2]。Suh等[3]研究揭示了ABEmax具有更强的碱基编辑效率和精度，可以最小的脱靶水平纠正无义突变,恢复了RPE65蛋白的表达。本研究利用PB转座系统建立了稳定表达ABEmax的工具细胞系，不仅能测试不同sgRNA编辑能力，还可以进行饱和基因组编辑，从而为基因变异提供功能评估，为遗传性疾病潜在的单核苷酸突变的全面功能分析提供可能。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1细胞和质粒HEK293T细胞、PiggyBac载体、PB-Helper质粒、pCMV-ABEmax质粒、pGL3-U6-sgRNA-EGFP质粒由上海科技大学黄行许实验室赠送；Trans10感受态细胞购自Transgene公司。

1.1.2主要试剂及仪器高保真PCR试剂、同源重组试剂盒、逆转录试剂和SYBRGreen反应混合液购自南京诺唯赞公司；BsaI内切酶、T4 DNA Ligase购自 NEB公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、全基因组提取试剂盒购自Axygen公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清、青-链双抗、胰酶购自Gibco公司；lipo2000脂质体购自Invitrogen公司；显微镜(Nikon)，流式细胞仪(Arial II，BD)，离心机(Eppendorf)，细胞培养箱(Thermo Fisher)。

1.2 载体构建

1.2.1pPB-ABEmax载体构建利用PCR技术以pCMV-ABEmax质粒为模板扩增ABEmax基因，以PiggyBac载体为模板制备线性化骨架，利用同源重组的方法将ABEmax元件整合到PiggyBac空载体中。扩增过程中用的引物ABEmax-F：5’-atgaaacggacagccgacggaagcgagtt-3’；ABEmax-R：5’-gactttcctcttcttcttgggctcgaatt-3’；PB-F：aagaggaaagtcgaattcgaaggatccgcggccgct；PB-R：tgtccgtttcatggtggctctagagtaggcgccggt。

1.2.2pGL3-U6-Test-sgRNA的载体构建首先用BsaI酶切pGL3-U6-EGFP载体，37℃酶切30min，琼脂糖凝胶电泳及切胶回收后-20℃保存。Test-sgRNA的上下游引物(10μM)各取10μl混合，加热至 95 ℃后缓慢降温至 25 ℃。利用T4 DNA连接酶将退火后的基因片段与酶切后的pGL3-U6-EGFP载体连接并转化至大肠杆菌感受态细胞中，利用菌落PCR和琼脂糖凝胶电泳挑选阳性克隆，并对阳性克隆进行测序验证。将连接成功的pGL3-U6-Test-sgRNA阳性克隆菌液保存和质粒提取。

1.3 细胞实验

1.3.1细胞培养和转染HEK293T细胞用含有10%胎牛血清、1%青-链双抗的DMEM完全培养基于37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。将生长状态良好的细胞接种到6孔板，待细胞密度达到60%时进行转染，将pPB-ABEmax和PB-Helper质粒以0.5:1、1:1、1.5:1和2:1的配比分别共转染细胞，转染4h后更换新鲜的DMEM完全培养基。转染24 h后弃去原培养基，加入含有3μg/ml嘌呤霉素的完全培养基进行药杀处理。药杀48h后更换为含有2μg/ml嘌呤霉素的完全培养基培养4～6d。每天观察细胞状态，确保阴性对照组细胞全部死亡。

1.3.2单克隆细胞分选和鉴定将筛选出来的细胞群制成单细胞悬液，利用流式细胞分选仪分选至96孔板中，使细胞含量为1个/孔。2周后将生长状态良好的单细胞群扩大培养并传代。提取单克隆细胞株的基因组DNA并进行PCR扩增(含 PCR mix、Primer-PB-F：5’-ctgcggctgatctatctg-3’和Primer-PB-R：5’-cgaagttgctcttgaagtt-3’)及琼脂糖凝胶电泳，HEK293T细胞作为阴性对照，鉴定ABEmax基因是否成功插入到HEK293T细胞基因组中。

1.3.3实时荧光定量PCR检测ABEmax转座效率将鉴定到成功插入ABEmax目的基因的HEK293T单克隆细胞系扩大培养至6孔板中，使用TRIzol试剂提取细胞RNA，对RNA浓度进行定量。将500ng RNA反转录得到cDNA，使用染料法荧光定量预混液进行实时定量反应，SYBR Green 10 μl，qPCR引物各0.5 μl，cDNA 1μl，H2O 8μl，以GAPDH为内参，每组3个生物学重复。qPCR引物PB-qPCR-F：5’-cccaagaggaacagcgataag-3’；PB-qPCR-R：5’-ccaccaccagcacagaatag-3’；GAPDH-qPCR-F：5’-GGTGTGAACCATGAGAAGTATGA-3’；GAPDH-qPCR-R：5’-GAGTCCTTCCACGATACCAAAG-3’。结果分析过程中采用2-ΔΔCt分析PB系统对ABEmax基因的转座效率。

1.3.4编辑效果分析将鉴定到成功插入ABEmax目的基因的HEK293T单克隆细胞系扩大培养至24孔板中，当细胞密度达到80%时，转染用于测试编辑效果的Test-sgRNA-EGFP，转染48h后利用流式细胞术分选EGFP+的细胞，提取基因组并扩增靶点基因片段(Test-PCR-F：5’-GCCCACGGTCACTTCTTGTT-3’；Test-PCR-R：5’-CTCCTTGGTCCAGGTTCTCG-3’)，利用Sanger测序和EdiR网站[4]分析窗口内可编辑位点的编辑效率。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 载体构建

PiggyBac的工作系统包括携带目的基因的PB工作质粒pPB-ABEmax和包含转座酶的辅助质粒PB-Helper(图1，1703页)。琼脂糖凝胶电泳检测到PCR扩增得到的ABEmax目的基因片段大小约5600bp，PB载体扩增片段约6100bp，利用同源重组方式将ABEmax基因整合到PB载体骨架中，最终得到的pPB-ABEmax重组质粒大小为11 565 bp，辅助质粒PB-Helper大小为8531 bp(图2，1703页)。pGL3-U6-Test-sgRNA最终在细胞内发挥功能的片段(图3，1703页)，在U6启动子的作用下，将带有20nt的guide序列和sgRNA骨架的sgRNA转录出来发挥其引导作用。

2.2 HEK293T细胞群的转座与编辑情况

将pPB-ABEmax和PB-Helper质粒以0.5:1、1:1、1.5:1和2:1的摩尔比分别共转染细胞，嘌呤霉素药物处理后利用RT-qPCR检测细胞中ABEmax基因的表达水平。与阴性对照组(NC)相比，每组中均有ABEmax基因的表达，且1:1和1.5:1组的ABEmax表达水平更高(图4，1703页)。后续转染实验采用pPB-ABEmax和PB-Helper质粒摩尔比1:1进行。该细胞群对pGL3-U6-Test-sgRNA编辑能力测试结果(图5，1703页)：sgRNA的20nt guide序列中，第4，6和8位发生编辑，其中4和8位的编辑水平约30%，第6位的编辑水平约50%，编辑窗口～4～8位。

2.4 单克隆细胞转座效果分析

验证过具有编辑效果的HEK293T细胞群经过单克隆分选和扩大培养后得到12株细胞系，PCR及琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均有ABEmax基因的插入(图6，1704页)；RT-qPCR结果显示，相比于HEK293T细胞，这12株细胞均能在RNA水平检测到ABEmax基因的表达，其中序号3，5，6，7和11的ABEmax基因表达水平较高(图7，1704页)。

2.5 单克隆细胞编辑效果分析

对12株单克隆细胞分别转染Test-sgRNA进行编辑效果测试与分析，结果显示，序号1和2细胞株几乎无编辑发生，剩余10株细胞均有不同程度的A>G编辑发生(图8，1704页)。利用EdiR对不同细胞株编辑水平进行定量分析，横坐标表示sgRNA靶向基因序列，编辑位点中颜色的深浅表示A>G被编辑程度，以HEK293T细胞转染sgRNA和ABEmax作为对照，编辑窗口为4～8位，第6位A的编辑效率最高，细胞株第3～12号也同样发生不同程度的A>G编辑，且编辑窗口仍保持不变，其中3和9号细胞株的编辑效率相比其他细胞株更高，其中3号的第4，6和8位A>G的编辑效率分别为(34.0±3.22)%，(45.0±2.52)%和41.0±2.65)%；9号第4，6和8位A>G的编辑效率分别为(31.33±3.48)%，(42.33±1.45)%和(36.33±2.03)%；与HEK293T细胞转染sgRNA和ABEmax的对照组的第4，6和8位A>G的编辑效率(29.61±3.18)%，(43.67±2.03)%和(30.33±5.36)%相比无统计学差异(图9，1704页)。

3 讨论

PiggyBac系统作为一种非病毒载体，因其操作方便、载体容量大、安全性高、携带目的基因稳定表达，是目前非常有吸引力的基因治疗载体之一[5]。PB转座系统包含有供体质粒部分和辅助质粒部分，其中，供体质粒由PB的两端ITR序列需要插入的供体基因片段和筛选标记组成；辅助质粒起到表达转座酶的作用。PB转座子的插入位点为TTAA，但不是AT富含区[6]，基因组中富含TTAA位点，插入位点分布广泛，但有研究发现，转座过程与靶基因和PB转座子自身的甲基化状态密切相关，甲基化状态的DNA会抑制转座情况的发生，而且PB转座情况发生在内含子区域或基因间的概率明显高于蛋白编码区[7-8]。本研究结果与之一致，PCR及琼脂糖凝胶电泳检测结果显示HEK293T-ABEmax 1和2号细胞株均有ABEmax基因的插入，但利用Test-sgRNA进行编辑测试和分析时发现细胞并没有编辑效果，这可能是尽管PB系统将ABEmax转座到基因组内，但受限于基因的插入位置，影响了ABEmax的转录与翻译水平。

基因编辑技术是利用人工核酸酶对基因组进行靶向修饰的遗传工程技术，近年来，以CRISPR/Cas9为首的基因组编辑系统迅猛发展，成为当今生命科学领域的研究热点。但传统的CRISPR/Cas9系统对基因的精准编辑，特别是单个碱基编辑的效率相对较低。碱基编辑工具是以CRISPR/Cas9为基础，将催化结构域受损的Cas核酸酶(只能切割单链，不产生DSB)与单链DNA脱氨酶融合，在sgRNA的引导下无需供体DNA即可实现单碱基的变化(C→T, G→A和A→G, T→C)[9]。根据脱氨酶的特征可以将碱基编辑分为两种，胞嘧啶碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)。多项研究通过融合核定位信号以及密码子优化得到不同版本的ABEmax编辑器，不仅扩展了编辑窗口与范围，还提高了对腺嘌呤碱基A→G转换的编辑效率[10]。Cheng等[11]的研究使用腺嘌呤碱基编辑器ABEmax，在预测影响HbF表达的307个调控元件中引入10 156个单独的A·T→G·C的转换，并且量化了对红细胞HbF表达的影响，揭示了HbF调节的遗传复杂性，并为镰状细胞贫血的治疗提供了潜在的见解。Viswanatha等[12]的研究也是通过构建CRISPR工程化细胞系和全基因组突变策略进一步促进了蚊基因组的功能注释，为蚊子宿主细胞与病毒和其他病原体相互作用的潜在新发现奠定了基础。遗传变异的解释是目前基因组医学的限速步骤，多种研究都证实基因编辑工程化细胞系为基因的功能注释，蛋白定向进化，病原微生物与细胞间的相互作用等研究领域提供了良好的测试工具。本研究利用PB转座系统构建了稳定表达ABEmax的HEK293T工具细胞，该细胞系不仅能作为不同sgRNA编辑能力的测试工具，简化操作流程，节约成本，为进一步发掘遗传疾病的发生发展及基因疗法的开发奠定基础；还能为基因组饱和突变和基因功能注释等研究提供工具支持。

本研究应用PiggyBac转座技术，实现了碱基编辑工具ABEmax基因在HEK293T细胞中的稳定插入，并获得了具有腺嘌呤碱基编辑能力的HEK293T-ABEmax细胞株，为后续碱基编辑的相关研究提供了稳定的工具细胞，并且有望与高通量测序结合建立全基因组饱和突变库，从而有助于为遗传疾病潜在的基因变异提供功能评估。