基于网络药理学探讨桑寄生-续断药治疗多囊卵巢综合征作用机制

宫玮珩 刘雁峰* 曹一鸣 王悦竹 郑志博 潘 雪

1.北京中医药大学(100029)；2.中国中医科学院广安门医院

多囊卵巢综合征(PCOS)是女性生殖内分泌系统疾病，主要临床表现为排卵障碍、高雄激素以及卵巢多囊样改变[1]，在我国发病率为5.61%[2]。目前病因和发病机制尚不明确，临床多采用激素调节药物、促排卵药物以及避孕药物等治疗[3]，长期服用易导致多种不良反应[4]。中医药在治疗PCOS中发挥了独特优势，能够有效改善患者激素水平及临床症状[5]，降低临床不良反应率。续断补肝肾、利关节、温补肾阳；桑寄生益血脉、祛风湿、滋阴养血，二者配伍具有补肝肾、强筋骨、安胎的功效。苏恒香等[6]分析治疗PCOS用药规律发现，桑寄生-续断用药频次为361，频率为65.62%；张文静等[7]分析治疗PCOS伴不孕症的用药规律发现，在846张处方中桑寄生-续断用药频数为362，频率为42.79%。因此，运用网络药理学方法探讨桑寄生-续断配伍治疗PCOS潜在机制，可为临床治疗提供理论依据。网络药理学是基于系统生物学、药理学、计算机生物学、网络分析等多学科相融合的一种新方法[8]；是从整体上分析药物的活性成分、靶点、通路以及疾病间相互作用关系[9]，与中医的整体观相契合。通过构建“药物-疾病-靶点”网络图，从分子水平上揭示药物治疗疾病的潜在作用机制。本研究运用网络药理学方法，对桑寄生-续断药物中的活性成分进行筛选，预测其治疗PCOS的新靶点及相关通路，为后续研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 桑寄生-续断活性成分筛选

以“桑寄生”、“续断”为关键词在TCMSP平台检索两味药的所有活性成分，以口服生物利用度(OB≥30%)、类药性(DL)≥0.18为筛选标准，筛选得到桑寄生-续断的有效活性成分，并通过Swiss Target Prediction数据库预测得到桑寄生-续断有效活性成分相对应的靶点，将上述得到的靶点借助Uniprot数据库进行基因的标准化处理。

1.2 PCOS疾病靶点的获取

以“polycystic ovary syndrome”为关键词，在OMIM(http://www.omim.org/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库检索，得到PCOS疾病相关靶点，应用Uniprot数据库对疾病靶点进行基因标准化处理。

1.3 桑寄生-续断治疗PCOS的潜在靶点

将桑寄生-续断药物靶点与PCOS疾病靶点取交集，然后将所取交集导入Venn(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在线平台，得到药物与疾病的靶点交集Venn图。

1.4 药物-成分-疾病-靶点网络图

将药物的活性成分及潜在靶点，以及疾病名称和药物疾病交集靶点导入至Cytoscape3.7.2软件中，构建“药物-成分-疾病-靶点”网络图，利用“Network Analyzer”进行功能分析，其中节点代表桑寄生-续断及其活性成分、疾病、靶点，边代表桑寄生-续断与成分、成分与疾病、疾病与靶点之间的相互作用关系。

1.5 PPI网络图构建及核心靶点筛选

将桑寄生-续断治疗PCOS的交集靶点导入至STRING(http：//string-db.org)在线平台，将物种限定为“Homo sapiens”，获得靶蛋白之间的互作关系，得到PPI网络图。将STING数据库得到的数据以tsv格式导入至Cytoscape3.7.2软件中，以自由度(Degree)值大于平均值为筛选标准，得到桑寄生-续断治疗PCOS的核心靶点。

1.6 GO 生物富集分析与KEGG通路富集分析

将桑寄生-续断治疗PCOS的交集靶点导入至DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)数据库，将物种限定为“Homo sapiens”，得到GO生物过程的3个模块，分别为生物过程(BP)、分子功能(MF)、细胞组成(CC)，以P<0.05为筛选标准，将筛选结果导入至Omi share Tools(http://www.omicshare.com/tools/index.php/)在线平台绘制成气泡图展示；同时以P<0.05为筛选标准得到桑寄生-续断治疗PCOS的相关通路，根据排序绘制成表格。

2 结果

2.1 桑寄生-续断药物活性成分收集

通过在TCMSP数据库检索得到桑寄生-续断的活性成分，以OB≥30%，DL≥0.18为筛选标准，筛选得到有效活性成分10个，其中桑寄生2个，续断8个，相对应靶点共计181个，删除重复值后得到药物最终靶点105个，具体信息见表1。

表1 桑寄生-续断药物活性成分

2.2 药物-疾病交集靶点Venn图

通过OMIM和GeneCards数据库共检索得到2164个与PCOS相关疾病靶点。将上述筛选的105个桑寄生-续断的潜在作用靶点，映射到与PCOS相关疾病靶点中，共得到77个交集靶点，制成Venn图展示(图1，1701页)。说明桑寄生-续断可能通过这些靶点参与治疗PCOS。

2.3 药物-成分-疾病-靶点网络图

利用Cytoscape3.7.2软件构建“药物-成分-疾病-靶点”网络图(图2，1701页)，图中共有121个节点，其中“蓝色与红色”代表药物的活性成分，“橙色”代表靶点，绿色代表药物与疾病，其中MOL000359-谷甾醇为桑寄生与续断共有的活性成分，MOL000098-槲皮素、MOL000358-β-谷甾醇、MOL003152-龙胆根素、MOL000359-谷甾醇等活性成分的度值分别为88、52、23、14，说明以上成分可能在桑寄生-续断治疗PCOS中发挥关键作用。

2.4 PPI网络图构建及核心靶点筛选结果

将桑寄生-续断治疗PCOS的交集靶点导入至STRING 数据库中分析，得PPI网络图(图3，1701页)。图中共有77个节点，745条边，平均节点值为19.4；节点代表靶蛋白，边代表靶蛋白之间的相互作用关系。将STRING 数据库得到的文件以tsv格式导入至Cytoscape3.7.2软件，以Degree值>34为筛选标准，得到桑寄生-续断治疗PCOS的核心靶点网络图(见图4，1701页)，其中IL6、TNF、VEGFA、TP53、EGF、MAPK1、JUN、EGFR等靶点的度值分别为51、49、48、46、44、44、42、40，说明以上靶点是桑寄生-续断治疗PCOS的核心靶点。

2.5 GO生物功能富集结果分析

通过DAVID对桑寄生-续断治疗PCOS的交集靶点进行GO富集分析与KEGG通路富集分析。富集分析共得到GO条目277条，以P<0.05为筛选标准，其中得到BP条目34条，CC条目35条，MF条目57条，分别选取前20条相关数据制成气泡图展示(图5、6、7，1702页)。其中涉及的BP条目为一氧化氮生物合成过程的正调控(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)、细胞增殖的正调控(positive regulation of cell proliferation)、对缺氧的反应(response to hypoxia)；涉及的CC条目为细胞外空间(extracellular space)、细胞表面(cell surface)；涉及的MF条目为酶结合(enzyme binding)、类固醇结合(steroid binding)、类固醇激素受体活性(steroid hormone receptor activity)，说明桑寄生-续断可以通过调控多个生物学过程来治疗PCOS。

2.6 KEGG通路富集结果分析

KEGG通路富集分析得到98条信号通路，以P<0.05和FDR<0.05为筛选标准，最终得到17条核心通路，将上述通路制成表格见表2。进一步发现药物治疗疾病的靶点主要富集在癌症(Pathways in cancer)、HIF-1(HIF-1 signaling pathway)、肿瘤坏死因子(TNF signaling pathway)、雌激素(Estrogen signaling pathway)、PI3K-Akt(PI3K-Akt signaling pathway)等信号通路，提示桑寄生-续断可能通过以上通路参与治疗PCOS。

表2 KEGG通路富集分析结果

3 讨论

PCOS是现代医学病名，祖国传统医学中将其归属于“不孕”“经闭”“月经后期”等范畴。各医家普遍认为多与肾虚、脾虚、肝郁、冲任损伤、痰郁阻滞胞宫等相关[10]。徐莲薇等[11]认为PCOS病机多以肾虚为主，肾虚易致阴阳气血失常，壅阻冲任胞脉，气血瘀滞成瘕，使卵巢增大，卵子难以排出，因此在临床中强调多用补肾药物，促进月经来潮。近年来，中医药具有多成分、多靶点、多途径等特点作用于POCS逐渐被医学界认可。桑寄生与续断二者配伍具有补肾安胎的功效，临床上常用于治疗PCOS，但作用机制尚不明确。因此本文运用网络药理学方法探究桑寄生-续断治疗PCOS的作用机制，以期为桑寄生-续断临床应用提供科学依据。

通过检索TCMSP数据库发现，桑寄生-续断的主要活性成分有槲皮素、谷甾醇、β-谷甾醇、龙胆根素等，说明可能通过这些有效活性成分参与治疗PCOS。槲皮素能够有效改善高激素血症，从而改善卵泡发育和黄体化，增加正常的卵巢卵泡[12]；临床多采用抑制胰岛素抵抗治疗PCOS，槲皮素能够有效改善胰岛素抵抗和慢性炎症来对抗PCOS并发症[13]，其机制可能与通过抑制TLR/NF-κB信号通路，改善多囊卵巢胰岛素抵抗微环境炎症，从而逆转胰岛素抵抗[14]。β-谷甾醇调节PCOS子宫内膜容受性，协调性激素平衡，这可能与肠道菌群结构和组成的改变有关，从而影响PCOS的病理过程[15]。进一步证实桑寄生-续断药对可以通过多个活性成分参与治疗PCOS。

桑寄生-续断治疗PCOS涉及多个靶点，其中IL6、TNF、VEGFA、TP53、EGF、MAPK1、JUN、EGFR等靶点的度值较高，在治疗过程中处于核心地位。IL6是慢性亚临床炎症的重要炎症因子，能够引起胰岛素抵抗参与PCOS疾病的发生发展，PCOS患者Gal-3与IL-6呈正相关，可能通过胰岛素抵抗和慢性炎症协同作用参与治疗PCOS[16]。轻度炎症反应在PCOS疾病的发生发展中起促进作用，TNF-α是TNF的一种，可参与炎症反应、细胞坏死及血管的形成，且能引起卵泡膜的间质细胞增生和凋亡，导致血清TNF-α水平增高[17]。VEGFA是VEGF家族中一员，在女性生殖系统中主要来源于颗粒细胞和巨噬细胞[18]，该因子在多囊卵巢综合征中高表达[19]，且水平变化可影响PCOS卵母细胞的成熟[20]。TP53能够抑制细胞凋亡，通过调节细胞周期的G1到S期和基因组的完整性来控制细胞增殖，异常高表达能影响PCOS患者大窦卵泡凋亡颗粒细胞核的卵泡发育[21]。有研究表明，PCOS患者TP53水平降低，MAPK1水平较高，导致胰岛素抵抗[22]。桑寄生-续断中的活性成分可能通过以上核心靶点发挥抗炎以及胰岛素抵抗作用参与治疗PCOS。

GO生物过程主要涉及一氧化氮生物合成过程的正调控、细胞增殖的正调控、对缺氧的反应、细胞外空间、细胞表面、酶结合、类固醇结合、类固醇激素受体活性等生物过程，说明桑寄生-续断可能通过以上生物过程参与治疗PCOS。通过对KEGG通路富集分析，发现桑寄生-续断靶基因主要富集在癌症信号通路、HIF-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、雌激素信号通路、PI3K-Akt信号通路等信号通路上，说明桑寄生-续断中的活性成分可能通过以上通路治疗PCOS。雌激素是由卵巢和胎盘分泌的重要激素，其受体信号通路转导在PCOS的发生和发展中发挥重要作用[23]。TNF作为TNF信号通路上的重要因子，其信号转导通路可以介导细胞的增殖、生长、分化等生物学效应，在PCOS患者中TNF因子的高表达可以间接影响自身信号通路中相关因子表达，提示TNF及其信号通路上相关因子可以协同发挥作用参与治疗PCOS[24]。PI3K-Akt信号通路是体内参与糖脂代谢的重要信号通路，由于胰岛素主要通过PI3K-Akt信号通路调节代谢，多数PCOS患者存在胰岛素抵抗，PI3K-Akt信号通路的过度活化，可以间接影响患者子宫内膜过度增殖和发生癌变[25]。黎慧[26]利用自拟排卵汤联合炔雌醇环丙孕酮片治疗PCOS，其作用机制与调控PI3K-Akt信号通路来降低体内雄激素含量有关。缺氧是唯一已知的天然存在的激活HIF-1转录因子的信号，研究发现PCOS女性HIF-1α蛋白表达明显低于对照组，说明HIF-1α可能参与PCOS女性子宫内膜功能障碍的分子机制[27]。以上研究表明，桑寄生-续断中的活性成分可能通过调控多通路参与治疗PCOS。

综上所述，桑寄生-续断中的活性成分协同发挥治疗作用，体现了其“多成分-多靶点-多通路”的特点。本文运用网络药理学方法预测了桑寄生-续断参与治疗PCOS的作用靶点及其相关信号通路，从分子水平上揭示了治疗PCOS的潜在机制，为后续研究提供一定的理论依据。