IFN-γ、IL-2联合检测在结核病中的诊断价值

廖家吉 杨晓辉 蒲渝成 青建植

结核病是全世界人类最常见的细菌感染之一，由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染造成，但绝大多数MTB感染者无临床症状。近年来，随着MTB耐药菌的出现，全世界范围内结核病的感染和传播水平不断升高。世卫组织统计资料表明，全世界三分之一以上的人曾感染过MTB，其中10%发展为活动性结核病者，每年因其死亡人数高达300万以上[1]。而我国作为结核病流行重灾区，对结核病的早期诊断和预防必须十分重视[2]。由于影像学检查缺乏特异性，因此临床上诊断结核病主要依靠病原学检测，但MTB分离培养和抗酸杆菌涂片法的诊断阳性率偏低，且对活动性肺结核诊断敏感性不足[3]。因此，急需一种快速、简便且准确的新诊断方法。在机体受到MTB感染时，主要依靠激活CD4+T细胞介导的免疫功能来清除，而分泌干扰素-γ（IFN-γ）和白介素-2（IL-2）细胞因子的CD4+T细胞与抗结核感染紧密相关[4]。因此，本研究通过分析结核病患者IFN-γ和IL-2的表达水平，并探讨IFN-γ、IL-2及联合检测对结核病的诊断效能，为临床辅助诊断结核病提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2021年5-7月广西壮族自治区胸科医院收治的462例疑似结核病患者作为研究对象。纳入标准：年龄≥15岁；均接受结核病临床症状、体征、胸部影像学、细菌学检测和组织病理学检查；确认结核病患者均接受常规治疗并进行抗结核疗效评估；临床资料完整。排除标准：具有自身免疫性疾病或免疫缺陷病毒感染；妊娠、接受长期免疫抑制剂治疗；合并恶性肿瘤及严重肝、肾器官功能不全严重疾病。男283例，女179例；年龄15～92岁，平均（56.27±16.13）岁。按照2018年最新实施的肺结核诊断标准（WS 288-2017），其中确诊结核病232例，纳入结核组，非结核病230例纳入组非结核组。232例结核病中继发性肺结核179例，肺外结核53例（含结核性胸膜炎25例，结核性关节炎13例，结核性腹膜炎7例，结核性脑膜炎5例及颈部淋巴结核3例）。结核组年龄15～88岁，非结核组年龄17～92岁。两组一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。本研究经过本院伦理审查委员会审核批准通过，患者自愿参与本研究并知情同意。

表1 两组一般资料比较

1.2 方法

两组均进行结核特异性细胞因子IFN-γ和IL-2检测。采集患者外周静脉血（每份不少于4 ml）至含肝素抗凝剂采血管中，加入等体积RPMI-1640（天津灏洋，RPMI1640LT，规格：500 ml/瓶）混匀后以（2～3）∶1加入淋巴细胞分离液（天津灏洋，LTS1077，规格：200 ml/瓶）上层，室温梯度离心后吸取单个核细胞（PBMCs）层至RPMI培养液，计数后根据数量稀释至工作浓度，取50 μl无血清培养基至空白对照孔，50 μl结核特异性融合蛋白至检测孔，50 μl阳性刺激物至阳性对照孔，之后加入配好浓度的细胞悬液，37 细胞培养箱（Biobase，QP-160）中培养 16～20 h。本研究采用结核分枝杆菌特异性细胞因子检测试剂盒（酶联免疫法）（DeFine.TB）[广州迪澳医疗科技有限公司，批准文号：国食药监械（准）字2014第3401353号，规格：28人份/盒]分别检测IFN-γ及IL-2表达水平，显色反应使用全自动酶标仪（深圳汇松，MB-580），试验操作严格按照说明书步骤进行。

1.3 观察指标

比较两组结核特异性细胞因子IFN-γ和IL-2的表达水平。分析IFN-γ、IL-2及联合检测对结核病的诊断效能。

1.4 统计学处理

本研究数据采用SPSS 19.0统计学软件进行分析和处理，符合正态分布特征的计量资料以（±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验。绘制受试者工作特征（ROC）曲线分析IFN-γ和IL-2及联合检测的诊断效能，曲线下面积（AUC值）比较采用Z检验，检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组结核特异性细胞因子IFN-γ和IL-2的表达水平比较

结核组IFN-γ和IL-2表达水平分别为（256.98±24.36）、（106.90±10.21）pg/ml；非结核组IFN-γ和IL-2表达水平分别为（15.96±1.98）、（8.13±1.67）pg/ml。结核组IFN-γ和IL-2表达水平均明显高于非结核组（t=9.818、9.510，P＜0.05），见图1。

图1 两组结核特异性细胞因子IFN-γ和IL-2的表达水平比较

2.2 IFN-γ、IL-2及联合检测对结核病的诊断效能

绘制IFN-γ和IL-2及联合检测的ROC曲线，结果发现联合检测AUC值明显高于IFN-γ、IL-2单独检测的AUC值（Z=2.817、3.036，P＜0.05）。联合检测的Youden指数最高为0.750，敏感度和特异度分别高达89.3%和85.7%，见表2、图2。

表2 IFN-γ、IL-2及联合检测对结核病的诊断效能

图2 IFN-γ、IL-2及联合检测诊断结核病的ROC曲线

3 讨论

尽管经过多年诊断技术的革新和发展，目前结核病的诊断仍然具有很大的挑战性。MTB携带的蛋白和多糖抗原表达丰富，故针对结核病诊断的免疫学方法虽多但特异性较差，而常规结核病病原体阳性培养和鉴定的敏感性较低，因此，临床上对诊断结核病，特别是活动性结核病提出了更高的需求。机体在被MTB感染后，会诱发巨噬细胞吞噬和消化MTB病原体，并将MTB抗原特异性片段递呈T淋巴效应细胞，刺激特异性CD4+T细胞迅速增殖和活化产生特异性淋巴因子包括IFN-γ、IL-2等激活巨噬细胞从而介导细胞免疫反应[5]。同时，部分活化的CD4+T细胞在介导免疫反应后分化为抗原特异性记忆T细胞，当再次遇到MTB刺激时，抗原特异性记忆T细胞会迅速增殖为效应T细胞发挥更高效的细胞免疫反应[6]。本研究结果显示，结核组IFN-γ和IL-2表达水平均明显高于非结核组（P＜0.05）。表明机体内CD4+T淋巴细胞或抗原特异性记忆T细胞在MTB感染后，接受特异性抗原刺激产生了大量IFN-γ和IL-2细胞因子。

IFN-γ是主要的Th1型细胞效应因子，具有广泛的抗细菌和病毒及免疫调节的作用。既往研究表明，随着细胞免疫应答的启动，CD4+Th1细胞分泌IFN-γ与IL-2等细胞因子激活巨噬细胞，而在抗结核感染过程中IFN-γ是促进巨噬细胞活化的重要组成部分，被激活的巨噬细胞发挥强大的溶菌效应以杀伤结核分枝杆菌，在结核病的控制中举足轻重[7]。近年来，随着免疫诊断技术的飞速进步，开发出了以MTB的特异性抗原（CFP-10和ESAT-6）为抗原肽刺激的T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）法，MTB分泌的两种特异性抗原会刺激人体T淋巴细胞分泌IFN-γ，从而通过检测IFN-γ的释放效应来诊断结核病。在结核病诊断中取得了良好的效果，此方法因避免了患者因老年、免疫缺陷感染、自身免疫病及其他病原体感染带来的影响，在结核病的诊断中拥有较高的敏感性和特异性[8]。但有报道发现，在活动性肺结核治疗期间观察到患者T细胞体外应答下降，造成MTB分泌的特异性抗原（CFP-10和ESAT-6）刺激人体T细胞分泌IFN-γ的能力减弱，从而导致T-SPOT.TB在活动性结核病诊断中效果不甚理想[9]。

有报道显示，经ESAT-6/CFP-10刺激后抗原特异性记忆T细胞虽在28个月内持续分泌IFN-γ，但从治疗的第6个月开始ESAT-6/CFP-10特异性T细胞分泌IL-2的数量显著增加[10]。且在活动性肺结核治疗期间和治疗后的28个月中，ESAT-6/CFP-10特异性T细胞从开始的IFN-γ和IFN-γ/IL-2的CD4+T细胞共同占优势转变为以分泌IFN-γ/IL-2的CD4+T细胞为主，并在治疗期间和治疗后出现只分泌IL-2的CD4+T细胞。因此，在体外ELISpot检测未经治疗的活动性肺结核中，IFN-γ由两个相对比例不同的CD4+T细胞功能亚群分泌而来，且IFN-γ和IL-2分泌CD4+T细胞呈对比动态变化，单一的IFN-γ检测并不是活动性结核病的“金标准”。

IL-2具有广泛的生物活性，在机体启动的免疫应答过程中，T细胞和B细胞增殖分化离不开IL-2的激活，且抗原特异性记忆T细胞在IL-2的刺激下才会大量分泌IFN-γ对细胞免疫应答做出快速反应。研究发现，IL-2与IFN-γ一样均为MTB感染后CD4+Th1细胞分泌的结核特异性细胞因子，结核病患者的血液和病灶部位的淋巴细胞是在IL-2刺激下被激活而释放入血，且其与机体感染的炎症严重水平密切相关[11]。本研究发现，联合检测的敏感度为89.3%，而单独检测IFN-γ的敏感度为87.1%，这表明引入了IL-2作为联合诊断标志物，增加了结核病的诊断敏感度。且IFN-γ的特异度仅为74.3%，而IL-2的诊断特异度高达85.2%。Tan等[12]报道表明，对MTB特异性细胞因子表达分析证实，IL-2对活动性结核病例的特异度高于IFN-γ。在结核病感染过程中，MTB特异性T细胞在慢性感染晚期表达高水平的PD-1，从而限制了其分泌IL-2而不是IFN-γ的能力[13]。这可能是IL-2在结核病诊断中的高特异度的合理解释。本研究结果显示当IFN-γ和IL-2联合检测时，特异度进一步提高到85.7%。同时，联合检测的AUC值明显高于IFN-γ、IL-2的单独检测，提示联合检测的诊断效能更高，这得益于联合检测结合了IFN-γ高敏感性和IL-2高特异性的优点，能显著提高结核病的检出率。

综上所述，本次研究说明感染MTB后，结核病患者体内T淋巴细胞中IFN-γ和IL-2的表达水平急剧升高，可以作为结核病的诊断标志物。且对结核病进行IFN-γ和IL-2联合检测，可以有效提高结核病准确度并减少漏检的可能，这为结核病诊治及防控带来广阔的应用前景。