miR-762与sTREM-1 sFLT-1在急性肺损伤中的相关性研究

宋 洋， 贺晓楠

(1.北京老年医院， 北京 1000952.首都医科大学， 北京 100095)

急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)是危重病患者发病、死亡的重要原因，占所有重症监护室总人数的10%以上，占所有住院人数的4%[1,2]。据报道，部分群体ALI的死亡率达到60%，总体死亡率已至40%[3]。ALI已被重新分类，列为轻度或中度急性呼吸窘迫综合征。大部分ALI患者起初仅有短期的呼吸困难，最终发展成难治性呼吸衰竭[4]。因此早期诊断ALI十分重要。虽然病理生理学方面的最新进展不断发现与临床预后相关的生物标志物，但是仍缺乏在临床上诊断效果的评价。微小RNA(miRNA)是一种内源性保守的短链非编码单链RNA，能够通过与靶基因的结合抑制靶基因的转录过程，进而影响蛋白质的翻译，参与人类几乎所有疾病的发生过程[5]。miR-762是近几年新发现的一种miRNA，其参与多种癌症的恶化、肾脏损伤、肺损伤、心肌梗死等[6～8]。但是，miR-762在ALI患者的病情发展过程中的变化是否具有临床预测价值尚未有人研究。可溶性髓系细胞触发受体-1(Soluble myeloid cell trigger receptor-1，sTREM-1)、可溶性FMS样酪氨酸激酶1(Soluble FMS like tyrosine kinase 1，sFlt-1)是最近2年研究比较多的预测肺炎病情进展的生物标记物[8,9]。因此，此研究假设ALI患者中的miR-762与sTREM-1、sFlt-1存在一定的关联。本研究旨在探究miR-762在ALI患者血浆中与sTREM-1、sFlt-1之间的联系。

1 资料与方法

1.1一般资料:样本来自本医院2018年9月至2021年9月期间接诊的肺损伤患者60例，其中急性危重患者30例，轻症患者30例。同时采取同时期接受体检的健康血样30例。所有受试者或家属都知晓此事并签署同意书。mMRC评分表示肺损伤的程度，0、Ⅰ、Ⅱ级为中低度损伤患者；Ⅲ、Ⅳ级为重度损伤患者。医院确诊肺损伤的患者(轻度呼吸困难、中度呼吸困难和重度呼吸困难)次日到医院采血站空腹采集静脉血5mL。所有研究对象的血样均放置在-80℃保存，备用。人可溶性髓系细胞触发受体-1(sTREM-1)检测试剂盒、人可溶性FMS样酪氨酸激酶1(sFlt-1)检测试剂盒均购自上海远慕生物科技有限公司；血浆microRNA提取试剂盒购自杭州昊鑫生物科技股份有限公司；miRNA cDNA第一链合成试剂盒购自北京赛尔瑞成生物公司；miRNA荧光定量试剂盒购自北京天根生物。实验所用引物的设计、合成均由上海吉玛生物完成。

1.2方 法

1.2.1患者APACHEⅡ评分:急性生理学及慢性健康状况(Acute physiology and chronic health evaluation，APACHEⅡ)评分系统对研究对象进行评分，观察各组研究对象的得分情况。

1.2.2ELISA检测血浆sTREM-1、sFLT-1的含量:取出待检测的血浆，严格按照人可溶性髓系细胞触发受体-1(sTREM-1)检测试剂盒、人可溶性FMS样酪氨酸激酶1(sFlt-1)检测试剂盒要求操作，检测血浆中sTREM-1、sFLT-1的含量。

1.2.3RT-qPCR实验检测血浆miR-762表达:将待检测的血浆用血浆microRNA提取试剂盒提取所有miRNA，再用miRNA cDNA第一链合成试剂盒将其合成cDNA，最后用miRNA荧光定量试剂盒检测其中miR-762的表达。以U6作为内参，2-△△Ct法计算miR-762的相对表达水平。采用总体积20 μL的反应体系，加10 μL模板，上下游引物各2 μL，双蒸水补齐。反应程序为95℃反应2min，95℃反应20s，再60℃退火反应30s，72℃反应40s，进行42个循环。miR-762上游引物为ACACGGGGCUGGGGCCGGGGCCGAGCGCCTC，下游引物为CTCAGGGGCUGGGGCCGGGGCCGAGCCAGA；U6为通用引物。每个样本重复3次，实验重复3次。

2 结 果

2.1不同程度肺损伤患者的APACHEⅡ评分:与正常组相比，中低危组和高危组患者APACHEⅡ评分均显著升高，与中低危组相比，高危组患者APACHEⅡ评分也显著升高(P<0.05)，见表1。

表1 肺损伤患者的APACHEⅡ评分情况

表2 sTREM-1 sFLT-1在肺损伤患者血浆中的含量

2.2sTREM-1、sFLT-1在不同程度肺损伤患者血浆中的表达:与正常组相比，中低危组和高危组患者血浆中sTREM-1、sFLT-1的含量均显著升高，与中低危组相比，高危组患者血浆中sTREM-1、sFLT-1的含量也显著升高(P<0.05)，见表2。

2.3miR-762在不同程度肺损伤患者血浆中的表达:与正常组相比，中低危组和高危组患者血浆中miR-762的相对表达量均显著升高，与中低危组相比，高危组患者血浆中miR-762的相对表达量也显著升高(P<0.05)，见表3。

表3 miR-762在肺损伤患者血浆中的相对表达量

2.4血浆miR-762含量预测不同程度肺损伤的诊断价值:通过绘制ROC曲线，显示血浆miR-762相对表达量预测中低危、高危肺损伤患者的曲线下面积(Area under curve，AUC)为0.987，95% 置信区间为0.9688～1.000，如图1所示。

图1 中低危、高危肺损伤患者血浆miR-762的ROC曲线

2.5miR-762与APACHEⅡ评分及sTREM-1、sFLT-1表达水平的相关性分析:结果如图2所示，血浆中miR-762的相对表达量与APACHEⅡ评分及sTREM-1、sFLT-1的相关系数r分别为0.386、0.321、0.432，均呈正相关，95% CI分别为0.124～0.493、0.2450～0.586、0.197～0.548。

图2 血浆miR-762相对表达量与APACHEⅡ评分及sTREM-1、sFLT-1的相关性分析

3 讨 论

miRNA参与调控肺损伤的整个发生、发展过程已经得到很多研究的证实。最近不断有研究发现调控ALI的新miRNA，如miR-26a-5p能够通过靶向结缔组织生长因子CTGF减轻脂多糖诱导的A549细胞的炎症反应和凋亡，miR-499-5p能够减轻脓毒症肺损伤小鼠肺组织细胞的凋亡并抑制炎症反应，miR-92a作为药物注入ALI小鼠肺部具有明显的抗炎抗凋亡功效[10,11]。miR-762在ALI中的功能也是近两年才被发现的，目前，miR-762在肺损伤中的作用及诊断价值仍在继续开发。miR-762在ALI患者、ALI模型小鼠和脂多糖诱导的A549细胞中的表达均升高，促进炎症反应，而miR-762拮抗剂可显著降低LPS处理的小鼠的炎症和ALI损伤，miR-762模拟物可加重小鼠的炎症和ALI损伤。本研究推断miR-762与肺损伤患者的病情进展紧密相关，其表达量可能具有一定的临床诊断意义。本研究结果显示，APACHEⅡ评分、miR-762的表达量随患者肺损伤的严重程度而逐渐升高，且miR-762作为诊断中低危患者和高危患者的肺损伤标志物具有较高的价值(AUC=0.987)，揭示了miR-762在肺损伤的临床诊断、治疗中的潜在作用。

TREM-1是单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞上的细胞表面受体，其通过激活TREM-1-自然杀伤激活受体相关蛋白(DAP12)信号通路促进促炎细胞因子或炎症趋化因子的分泌。可溶性TREM-1(sTREM-1)是TREM-1的一种特殊形式，可在人体体液中直接检测，也是传染病学中著名的生物标志物。sTREM-1水平可能会用于某些疾病的早期诊断、预后的预测，如ALI损伤。FMS样酪氨酸激酶1(FLT-1)是Ⅲ型受体酪氨酸激酶的一种糖蛋白,普遍存在于人体的血液系统、免疫系统和神经系统，sFLT-1为其中一种。近些年，sFLT-1常作为血管生成抑制剂在临床上发挥作用。血浆中sFLT-1的异常升高及定量表达与患者肺部的损伤及感染状况紧密相关，肺炎患者血浆中sTREM-1、sFLT-1的含量显著升高并且可作为重症肺炎患者病情监察的指标。本研究发现sTREM-1、sFLT-1的含量与患者的APACHEⅡ评分呈正相关，这均与前文的研究中的结果相一致。进一步进行相关性分析发现，血浆中miR-762的表达量与APACHEⅡ评分和sTREM-1、sFLT-1均呈正相关性，miR-762与在肺损伤过程中的作用也许可能与促进sTREM-1、sFLT-1的表达存在某种联系。由于本研究存在样本的地域限制和样本量的限制，可能存在不同地域或不同人种的肺损伤患者血浆中miR-762表达量的差异，因此，本研究得到的预测肺损伤患者病情的血浆miR-762截断值可能存在局限性。本实验室下一步将扩大样本纳入的范围和数量，探究miR-762在肺损伤中的功能与sTREM-1、sFLT-1之间的潜在关系。

综上所述，急性肺损伤患者中miR-762高表达，并与sTREM-1、sFLT-1的表达水平呈正相关，可作为预测急性肺损伤患者病情进展的生物标志物。