非洲猪瘟病毒的不同病原学检测方法比较

付玉亮

（山东省临沂市兰陵县动物疫病预防控制中心，山东临沂 277700）

非洲猪瘟最早起源于非洲，是世界动物卫生组织要求必须上报的传染病之一。自1921年以来，非洲猪瘟病毒在撒哈拉以南非洲国家和撒丁岛肆虐，该病的流行对养猪业和社会经济造成巨大影响。后来疫情陆续蔓延至欧洲、南美洲、欧亚交界等地，后又传入俄罗斯、乌克兰、波兰、意大利等国家，2014年立陶宛和波兰报道非洲猪瘟感染野猪的病例。2017年非洲猪瘟病毒在罗马尼亚和捷克共和国流行，2018年在保加利亚、匈牙利、比利时流行，同时，2018年8月我国也发生非洲猪瘟疫情。

从世界各国对非洲猪瘟的防控经验来看，目前该病只能通过流行病学监测、扑杀、无害化处理等措施处理，同时，需要提高生猪调运监管、生物安全措施，严格检疫等。不管是在生猪饲养环节，还是在生猪屠宰环节，监测预警尤为重要，是进行紧急处置的前提，要想做到“早、快、严、小”（即早发现、快处理、严格执行防控措施、损失最小）的处置原则，必须进行快速、准确的非洲猪瘟病毒诊断。

目前市场上已有多种可用的针对非洲猪瘟病毒的诊断试剂和诊断方法。常用的检测方法包括普通PCR、荧光定量PCR、LAMP等。2018年底、2019年初，中国动物疫病预防控制中心组织开展了第一次、第二次非洲猪瘟现场快速检测试剂评价工作，对荧光定量PCR类、等温扩增类、试纸条类检测试剂进行了比对评价，有26家生产商共30余个检测试剂产品可用于非洲猪瘟现场快速检测。本文对不同的非洲猪瘟病原学检测方法进行简单阐述，分析不同方法之间的优缺点，以期为准确诊断及监测非洲猪瘟病毒提供参考。

1 非洲猪瘟在我国的流行概况

非洲猪瘟病原为非洲猪瘟病毒（ASFV），ASFV为大型双链DNA病毒，具有包膜。根据非洲猪瘟病毒编码衣壳蛋白p72的B646L基因可将非洲猪瘟病毒分为24种基因型[1]。病毒基因组在170至193 kbp间变化，编码150～167种蛋白。非洲猪瘟病毒感染家猪和野猪，钝缘软蜱是该病毒的生物媒介，可以长期感染带毒，并成为重要的传染源，类似于病毒库。

非洲猪瘟病毒主要通过接触传播，易感动物接触染疫动物或被病毒污染的饲料、水、环境等可造成感染，有气溶胶短距离传播的可能。此外，人类活动是造成非洲猪瘟病毒传播的重要因素，生猪调运、猪肉加工运输等可造成该病毒快速、远距离传播。

非洲猪瘟的临床症状与很多疾病相似，加上低毒力毒株的流行，发病后的生猪没有典型症状，很容易与其他疾病混淆，这导致早期诊断困难，甚至在采取疫病控制措施之前病毒可能已经蔓延。

2018年8月，我国辽宁首次出现了非洲猪瘟疫情。农业农村部第一时间启动应急响应，对发病猪群进行了处理，虽然采取了扑杀、无害化处理等合理的综合防控措施，但疫情仍然迅速向全国各地蔓延，且传播速度很快。截至2018年12月31日，我国共报告家猪疫情97起，野猪疫情2起；2019年发生家猪疫情60起、野猪疫情3起；2020年发生家猪疫情18起、野猪疫情1起，2021年截至12月1日，发生家猪疫情14起。2018年发生的多起非洲猪瘟疫情与泔水饲喂、人员和车辆的流动有关，2019年、2020年生猪调运引发的疫情略有上升。

2 非洲猪瘟病毒的分离

非洲猪瘟病毒分离鉴定主要采用红细胞吸附试验。20世纪60年代Malmquist、Hay发现猪感染非洲猪瘟病毒的白细胞可以吸附红细胞，并于吸附后48 h裂解；而猪的其他任何病毒都不具有这个特性。因此该检测方法具有较高的特异性，时至今日仍是非洲猪瘟病毒检测的重要病原学检测方法。

3 病原快速检测方法

3.1 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR（Real-time PCR）从20世纪90年代开始快速发展，目前，实时荧光定量PCR是检测非洲猪瘟病毒最灵敏且广泛应用的方法。实时荧光定量PCR是在普通PCR的基础上，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号对反应进程实现实时监测，实现从定性到定量。荧光定量PCR对核酸检测的敏感性更高，特异性和检测效率也得到了提高，是普通PCR的升级技术。

世界动物卫生组织推荐的荧光定量PCR检测技术是根据非洲猪瘟病毒基因组中的保守序列B646L基因（编码p72蛋白）设计探针来进行病毒基因扩增，现在已建立多种病毒基因的荧光定量PCR检测，例如广州华医测检测科技有限公司与广州悦洋生物技术有限公司一起研究开发的非洲猪瘟病毒p72和CD2v双基因实时荧光定量PCR检测方法，其扩增效率在90%～110%，最低检出限为7.3～24.5 copies/μL，有很好的敏感性和特异性[2]。此外，还有研究者开发了多重荧光PCR检测方法用于不同猪病的鉴别诊断，如华中农业大学牛伟杰等[3]根据非洲猪瘟病毒、经典猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒的保守基因序列设计了三重荧光PCR引物进行多个病毒基因的检测，该方法有利于临床高效的鉴别诊断。

3.2 等温扩增技术

等温扩增技术（Isothermal amplification technology,IAT）也是一种新型的核酸体外扩增技术，等温扩增技术包括环介导等温扩增技术、交叉引物扩增技术、荧光重组酶介导等温扩增技术等。

3.2.1 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是国外学者在21世纪初研究开发的一种恒温核酸扩增方法，其反应条件简单，检测结果肉眼即可判断[4]。

LAMP技术已广泛应用于食品安全的病原微生物检测、动植物疫病诊断以及人类许多疾病的检测中。如章小洪等[5]将LAMP技术用于食品中沙门氏菌的检测，吕观等[6]将LAMP技术用于牛肉中金黄色葡萄球菌，而在非洲猪瘟病毒检测方面，王彩霞等[7]、James等[8]已研究报道了非洲猪瘟病毒LAMP检测技术。

3.2.2 交叉引物扩增技术

交叉引物扩增（Crossing priming amplification,CPA）技术是我国第一个具有自主知识产权的核酸扩增技术[9]。交叉引物扩增需要设计3～8条互补引物，设计的引物可识别DNA中的特定位点，并使用具有等温效应的聚合酶进行扩增。根据设计的引物数量，可将交叉引物扩增分为双交叉扩增和单交叉扩增，在Bst DNA聚合酶作用下进行目的片段延伸，不断循环杂交以得到大量扩增产物，扩增产物添加荧光染料后置于紫外光下观察，阳性样品可观察到荧光，阴性样品不显示任何荧光。交叉引物扩增已被用于肺结核、鸡呼肠孤病毒、鸡腺病毒及牛腹泻病毒等病原的检测。Fr czyk等[10]开发了用于非洲猪瘟病毒检测的CPA技术，可直接用于检测家猪或野猪血液和血清中非洲猪瘟病毒的DNA片段，无需提取核酸。该方法具有很好的特异性和很高的灵敏，检测结果与实时荧光定量PCR检测结果一致。

3.2.3 荧光重组酶介导等温扩增技术

荧光重组酶介导等温核酸扩增技术（Recombinase aided amplification,RAA）主要利用重组酶、DNA聚合酶等在39℃等温条件下进行核酸扩增。赵凯颖等[11]选取非洲猪瘟病毒保守基因B646序列为靶基因建立了实时荧光重组酶介导等温扩增方法，采用50 μL反应体系在等温条件下进行扩增，检测结果与实时荧光定量PCR检测结果一致。

4 不同病原学检测方法的优缺点

病毒分离进行红细胞吸附试验仍然是病原学最敏感的检测技术，但该方法对实验室人员、实验室条件及生物安全等条件要求严格，只能在特定的实验室开展，基层兽医实验室不能开展。红细胞吸附试验具有很高的特异性，但实验要求高且费时费力。实时荧光定量PCR检测技术特异性好、灵敏度高，但实验条件及仪器设备要求高，需要PCR仪、核酸提取仪等仪器设备，对实验室人员素质也有要求。

环介导等温扩增检测技术特异性强、敏感性高，不需要PCR仪等昂贵的仪器且检测时间短，结果判读简单易操作，可通过肉眼或电泳或比浊仪进行判定。但其引物的设计较复杂，且不能扩增较长的目的片段，易出现假阳性。交叉引物等温扩增操作简单，只需要在水浴锅内即可完成扩增，但该检测方法不稳定，反应体系复杂，也有假阳性出现。环介导等温扩增和交叉引物扩增2种检测方法的特异性没有显着差异，但灵敏度有差异，环介导等温扩增的灵敏度达到90%，而交叉引物扩增的灵敏度为70%，灵敏度都有待提高[12]。等温扩增技术操作简单，不需要昂贵的仪器设备，但气溶胶污染的风险较高。

5 小结

我国通过扑杀阳性猪群并做无害化处理，执行严格的消毒，通过排查和监测及时发现可疑病例及时处置；同时加强生猪调运监管，生猪跨省调运实行严格的检测和“点对点调运”等，使非洲猪瘟疫情得以控制。自非洲猪瘟疫情发生至今，我国的疫情发生数量逐年下降，但不可否认的是非洲猪瘟病毒已在我国“定殖”，实行非洲猪瘟病毒清除计划将是一项艰巨的任务和挑战。

非洲猪瘟病毒检测已成为基层兽医队伍的一项长期工作，在进行疫病防控时，可靠和快速的诊断对于防止疫情蔓延至关重要。世界动物卫生组织推荐的非洲猪瘟检测方法包括病毒分离、荧光PCR、ELISA等。实时荧光PCR应用最广泛，其灵敏度和特异性均可满足检测的需要，但检测成本较高，等温扩增检测技术作为低成本的快速检测方法，在某些场合可作为荧光定量PCR检测法的替代方案。