猪圆环病毒核酸检测技术研究进展

周婷婷 刘 帅

（1新疆维吾尔自治区牧业信息中心，乌鲁木齐 830000；2新疆畜牧科学院兽医研究所，乌鲁木齐 830000）

猪圆环病毒（porcine circovirus,PCV）是单股负链环状DNA病毒，为无囊膜的二十面体对称结构，属圆环病毒科（circovirdae）、圆环病毒属（circovirus）成员[1]。目前可以将猪圆环病毒分为猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪圆环病毒3型（PCV3）以及2019年在我国湖南某猪场新鉴定的猪圆环病毒4型（PCV4）[2]。PCV基因组大小约为1 700～2 000 kb，主要编码Rep蛋白和Cap蛋白，根据PCV的Cap蛋白进行系统发育分析是划分PCV基因型的有力工具。目前，PCV2主要流行的基因亚型为PCV2a、PCV2b以及PCV2d，而相关研究表明全球的PCV2流行情况已经由PCV2b向PCV2d转变[3-5]。而PCV3也存在多种亚型，主要为PCV3a、PCV3b以及 PCV3c[6]。PCV4在进化关系上与水貂圆环病毒（MiCV）最近。PCV3和PCV4的报道让临床上感染PCV的情况变得复杂，对养猪业造成了极大的危害。

在致病性方面，PCV1无致病性，而PCV2的致病性较高，主要引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征（postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）等一系列猪圆环病毒相关疾病，PCV2感染可以使猪出现免疫抑制，导致疫苗免疫失败的发生，造成其他病原的继发感染。PCV3首次于2016年在美国报道[7]，当地母猪出现繁殖障碍和皮炎肾病（PDNS）问题，经相关病原的测序及分析，将该新型病毒归类为PCV3型，随后PCV3在世界范围内被相继报道。PCV4在患有呼吸道疾病、肠炎和PDNS的猪群中首次被鉴定[7]。因此，了解PCV感染所造成的临床症状，建立高通量，快速的抗原、抗体检测方法具有重要的意义。近年来，科研工作者建立了许多新的检测PCV的方法，对于PCV致病机理的了解也越来越深入。因此，本文汇总了PCV感染所引起患病猪的临床症状以及近几年新建立的针对PCV的核酸检测技术，以期对临床上根据不同情况和应用方向来选择合适的检测方法提供参考。

1 宏基因组测序分析

宏基因组是指特定环境中全部微生物的总DNA或RNA。随着测序技术的发展，病毒宏基因组学和高通量测序技术（next-generation sequencing,NGS）已能够广泛应用于病毒的检测和鉴定。运用NGS对临床样品中存在的几乎所有微生物的基因组片段进行测序，然后根据可公开获得的基因组数据库进行重新组装，鉴定出样品中存在的核苷酸序列。PCV3的鉴定得益于这种技术，2016年美国当地的患病母猪出现PNDS和木乃伊胎症状，而通过PCR鉴定PCV2以及PRRSV等病原的核酸为阴性，Palinski等将[7]相关病料进行宏基因组测序，组装获得了2 000 bp的与PCV2相近的核苷酸序列，并通过滚环扩增鉴定引起这些临床症状的病原为PCV3。Franzo[8]等运用宏基因组学方法在患有仔猪断奶发育不全综合征（periweaning failure-to-thrive syndrome,PFTS）的猪群中检测出PCV3。此外，也检测到了PPV6、BoPV2的广泛存在。Blomstrom等[9]利用宏基因组测序分析技术探究了健康猪和患有PWMS的猪体内病毒的共感染情况，发现PCV2、TTSuV1、TTSuV2广泛存在于患有PMWS猪体内，然而这些病毒在健康猪体内也同样存在，但其含量相对较少。此外，该研究还鉴定了一种新型非典型猪瘟病毒（APPV）存在于欧洲患有PMWS猪的体内。Sun等[10]通过宏基因组测序分析，对我国1996—2016年的病料进行了PCV3的回溯性研究，发现最早于1996年我国的猪群中就已经存在PCV3。

2 多重PCR

多重PCR是通过在一个PCR体系中添加多对引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。相比于普通PCR，多重PCR具有快速鉴别诊断不同病原的优势，大大缩短了核酸检测时间和试剂消耗。Zhang等[11]建立的双重纳米PCR方法鉴别诊断PCV2和PCV3，其对于PCV2的检测限为9.32×101拷贝/μL，PCV3的检出限为9.16×101拷贝/μL，其灵敏度比普通双重PCR方法灵敏100倍，且扩增不会出现其他杂带。Yang等[12]建立了检测PCV的多重PCR，该方法对PCV1、PCV2或PCV3的检出限均为10拷贝/μL，通过扩增条带大小的不同鉴定检测结果。Liu等[13]建立了多重PCR检测和鉴别猪流行性腹泻病毒（PEDV）、传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪A型轮状病毒（RVA）、猪C型轮状病毒（RVC）和猪圆环病毒2（PCV2）等5种猪腹泻相关病毒，多重PCR的检测限为50拷贝。运用该方法检测了69个田间样品，其中PCV2的阳性率为37.7%、PEDV和RVC为4.3%、TGEV为2.9%、RVA为1.4%。

3 荧光定量PCR

荧光定量PCR是近几年来常用的临床检测病毒的一种方法，通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR过程，然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的PCR方法。目前有SYBR GreenⅠ染料法和TaqMan探针法，其中染料法操作简便，而探针法更加特异。Henriques等[14]建立了基于TaqMan探针的实时PCR方法检测样品中的PCV2 ORF1基因，该测定法可以检测至少3个质粒拷贝。李晓菲等[15]建立了检测PCV3的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法，其质粒检测范围为4.78×101～4.78×109拷贝/μL，较常规PCR方法的敏感度高100倍。Chen[16]建立了基于SYBR GreenⅠ的实时荧光定量PCR检测方法用于PCV3的检测。

此外，双重或多重荧光定量PCR是在临床上同时检测多种病毒的有力工具。Wang等[17]建立了多重qPCR检测方法用于检测和区分PCV3和PCV2。确定为每个反应质粒拷贝的检测下限（LOD），PCV3为17拷贝，PCV2为14拷贝。Li等[18]建立了检测PCV2和PCV3的双重荧光定量PCR检测方法，该方法对PCV2质粒的敏感性为2.9拷贝，对PCV3质粒的敏感性为22.5拷贝，运用该方法检测340份临床样品，其中PCV2与PCV3的混合感染率为27.6%。Kim等[19]建立了用于PCV2和PCV3快速鉴别诊断的多重荧光定量PCR检测方法，检出限均在PCV2和PCV3靶基因的50个拷贝以下。运用该方法检测国内某猪场的PCV感染情况，结果显示PCV2和PCV3单独感染率分别为21.7%和6.5%，而PCV3与PCV2混合感染率为28.3%。Zhao等[20]建立了基于TB GreenⅡ的双重qPCR以检测PCV2和PCV3，对于PCV2和PCV3的检出限分别为10和78拷贝/μL。该方法检测了56个组织样本，PCV2与PCV3共感染率为39.28%（22/56）。这些荧光定量PCR方法的建立可以用来对PCV2和PCV3进行快速的调查，以监测它们在猪场中的流行情况。

4 环介导等温核酸扩增技术

环介导等温核酸扩增（LAMP）检测方法是一种快速而简单的检测方法，可适用于实验室诊断和田间检测，该方法只需常规水浴或热阻即可进行反应。Zhou等[21]建立了用于快速检测PCV2 ORF2基因的LAMP方法。在63℃下60 min即可完成扩增，检测限接近DNA质粒的1个拷贝，比PCR更加灵敏。Park等[22]开发了一种使用羟基萘酚蓝的LAMP分析方法，用于快速可视化检测PCV3 Cap基因，扩增可以在62℃下40 min内完成，并且可以用肉眼目测检测结果，检测限为50个PCV3 DNA拷贝，与qPCR的拷贝数相当。Zheng等[23]建立的LAMP方法检测PCV3，在60℃水浴60 min即可完成扩增。该方法检测极限约为1×101拷贝。Wang等[24]建立了检测PCV3的LAMP方法，其检测限为1×101拷贝/μL。因此，RT-LAMP比常规PCR灵敏度更高，操作更加简便。

5 聚合酶螺旋反应

聚合酶螺旋反应（PSR）同样属于一种恒温扩增核酸的方法，其原理是运用一对寡核苷酸引物，在引物的5’端添加互为反向的核苷酸片段，在恒温条件下使目的基因螺旋式延伸，从而完成核酸的扩增。Ji等[25]建立的PSR可以在62℃水浴50 min即可精确扩增PCV3基因组。可以通过凝胶电泳或使用包含酚红和甲酚红指示剂的染料进行结果鉴定，检测极限为1.13×102拷贝/μL，特异性良好，运用PSR检测临床样品中的PCV3，其阳性检出率要高于RT-LAMP检测。

6 原位杂交技术

原位杂交技术（in situ hybridization,ISH）是利用设计的探针与组织或细胞上待测核酸互补配对，结合形成专一的核酸杂交分子，然后将待测核酸在组织或细胞上的位置显示出来的一种核酸检测方法。王晓捷等[26]针对PRRSV N基因和PCV2 Rep基因序列设计了2组特异性探针，利用RNAscope原位杂交技术分别检测了同一猪肺泡巨噬细胞（PAMs）中PRRSV和PCV2单独感染或PRRSV与PCV2共感染的情况，其检测结果与IFA结果一致。Phan等[27]利用原位杂交技术检测PCV3在感染猪的心脏和肺脏中的分布情况，结果表明PCV3在心肌细胞和心肌中的炎症细胞等多处存在，这些细胞都显示出弥漫性的肌浆、胞浆反应，而在肺组织切片未能检测到PCV3。Mora-Díaz等[28]运用原位杂交技术验证了PCV3分离株在CD/CD模型猪体内的复制，结果表明PCV3在心肌细胞、动脉中膜和内皮细胞以及炎性细胞内均有阳性信号。此外，在肾小管上皮、内皮细胞中同样存在PCV3 DNA。

7 小结

猪圆环病毒病对我国养猪业的危害日益严重，虽然有针对PCV2的灭活疫苗和亚单位疫苗在田间使用，但PCV2仍然在田间流行。随着对PCV3的检出以及对PCV3的回顾性研究越来越多，发现PCV3早在多年前便存在于猪体内[29]，临床上PCV2与PCV3的共感染情况严重，有研究表明PCV2与PCV3存在抗原性差异，PCV2疫苗并不能免疫猪群免受PCV3感染[30]，且由于PCV3的存在是否会影响PCV2疫苗的免疫效果尚不清楚[31]。目前仍没有PCV3的疫苗在临床上应用。此外，定期监测PCV抗体和开展PCV分子流行病学调查同样具有重要意义。

多重PCR、qPCR在快速鉴别诊断方面发挥着重要的作用，通过一次反应就能够鉴别出样品中的不同病毒，大大缩短了检测时间。而RT-LAMP、PSR由于其可视化、恒温快速的优势则更适合田间检测。而ISH和IHC更适合研究病毒在宿主体内的分布情况，能够准确检测病毒在组织或细胞中的定位情况。