巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium，Bm）的抑菌活性及定殖规律分析

谢强，夏建华，徐传涛，王飞，李慧，于卫松，孙惠青*

1.四川省烟草公司泸州市公司，四川省泸州市龙马潭区南光路374号 646000 2.中国农业科学院烟草研究所，山东省青岛市崂山区科苑经四路11号 266101

芽胞杆菌（Bacillus sp.）对多种土传病害和线虫具有抑制作用，兼有改善植物营养和促生作用，常用于植物病害的生物防治［1-3］。芽胞杆菌在植物根际定殖后，一方面可在幼根表面形成保护层，阻断病原菌入侵，并分泌细菌素、活性蛋白酶、脂肽类表面活性素（Suifactins）、伊枯草菌素（Iturins）和丰宁素（Fengycins）等抗生素，直接抑制根际病原菌的生长［1］；另一方面还具有解磷溶钾能力，克服镍（Ni）胁迫［4］，增加根干质量，促进植物生长［5］，提高植物抗氧化酶活性［4］和耐盐性［6］，从而诱导植物体产生系统抗性，抵御病原菌侵染［7］。例如Kakar等［7］研究发现，水稻根际芽胞杆菌Bk1、P1和Bk7不仅能抑制稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）和纹枯病菌（Rhizoctonia solani）的菌丝生长；还能通过产生吲哚乙酸、嗜铁素、脂肽类抗生素以及提高过氧化氢酶活性，进而促进植株生长并提高水稻抗性；同时还能在根际形成生物膜，显著抑制稻瘟病和纹枯病的侵染。根际有益菌发挥其促生防病作用的前提是能在植物根际有效定殖。检测定殖的方法有两种，一是利用抗生素诱导筛选抗药性菌株，借助抗药性平板计数定殖菌群；二是利用绿色荧光蛋白（GFP）构建融合菌株，借助激光共聚焦显微镜观察定殖菌群［8-9］，此方法能直接观察菌群定殖部位及生物膜的形成，但对于一些非模式菌株有时较难获得融合GFP的标记菌株。此外，有研究发现嗜铁枯草芽胞杆菌Bs-15［10］、蜡样芽胞杆菌Q-7［11］、地衣芽胞杆菌G-04［11］均能有效降解有机磷类或拟除虫菊酯类农药，可用于土壤修复及水治理。现已取得登记的芽胞杆菌制剂中，在烟草上用于防治黑胫病的产品有枯草芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌共11个产品，用于防治赤星病的有枯草芽胞杆菌3个产品，用于防治野火病的有枯草芽胞杆菌1个产品，用于防治青枯病的有解淀粉芽胞杆菌、多黏类芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌5个产品［12］。有关芽胞杆菌对植物病毒的抑制作用主要是体外钝化、抑制初侵染以及促进作物生长并提高抗性［13］，尚无登记药剂。本课题组前期研究发现，巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium，Bm）的发酵产物能促进烟苗根系发育和茎叶生长，且能在体外高效钝化烟草花叶病毒，其活性物质包括蛋白和非蛋白两类［14］，但其定殖效率及对烟草主要根茎类病害抑制效果的研究则鲜见报道。为此，通过室内生物测定进一步明确了Bm的抑菌（毒）活性，并通过抗药性筛选获得抗性标记菌株Bm-rif，测定其在烟草根际土壤中和叶面上的定殖能力，以及对烟草黑胫病和青枯病的田间防治效果，旨在为生物防治菌剂的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium）分离自烟草根际土壤，烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var.nicotianae）和烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）为中国农业科学院烟草研究所植物保护研究中心保存，TMV-GFP由清华大学刘玉乐馈赠。

三生烟NN（Nicotiana tobacum var.Sumsun NN）和NC89（N.tobacum var.NC89）种植于中国农业科学院烟草研究所温室中。

1%申嗪霉素悬浮剂（贵州遵义泉通化工有限公司）和3×1011cfu/g荧光假单胞杆菌可湿性粉剂（广东真格生物科技有限公司）均为市售。

1.2 Bm发酵上清液对烟草花叶病毒抑制作用的测定

将Bm接种到LB中，28℃、200 r/min培养72 h后得到菌株发酵液，将发酵液以10 000 r/min离心10 min去除菌体，得到发酵上清液［15］，利用半叶法测定其对TMV的抑制效果，配制成40倍浓度（质量分数）的TMV接种液［16］。试验组为发酵液或发酵上清液与接种液的等量混合，对照组为LB与接种液的等量混合，静置15 min。选取生长健康且叶面无病斑的三生烟NN烟株，在叶片正面主脉两侧分别摩擦接种试验组和对照组，每株接种3～4片叶，重复4株。26℃培养4 d，调查烟株枯斑数，并计算对TMV的抑制效果。

1.3 Bm无菌发酵上清液对黑胫病菌和青枯病菌抑制作用的测定

发酵上清液经0.22µm细菌滤膜除菌，为无菌发酵上清液，采用对峙平板法测定其对黑胫病菌的拮抗作用。无菌条件下，在燕麦平板中央接种直径为5 mm的病原菌菌饼，28℃培养3 d后，取直径为3 mm的无菌滤纸片，放置在距离菌饼四周1.5 cm处，吸取50µL无菌发酵上清液滴于滤纸片上，以滴加同体积的无菌水为对照，重复4次。28℃培养5 d，测量病原菌接种点至平板边缘辐射生长的距离R1，至拮抗菌方向辐射生长的距离R2，计算菌丝径向生长抑制率［17］。

采用抑菌圈法测定无菌发酵上清液对青枯病菌的抑制作用。吸取100µL青枯病菌菌悬液均匀涂布于LA平板上，取直径为3 mm的无菌滤纸片，在平板中呈三角放置，吸取50µL无菌发酵上清液滴于滤纸片上，以滴加同体积的无菌水为对照，重复4次。28℃培养2 d，测量抑菌圈直径［18］。

1.4 Bm抗药性标记

采用抗生素利福平（Rif）对菌株Bm进行抗药性标记。使用含有不同浓度Rif的LB培养液和LA固体培养基，对Bm进行抗性诱导和筛选，Rif浓度梯度依次为10、20、40、80、120、160、200µg/mL［19］。直至筛选出在200µg/mL的Rif中可稳定生长的抗药突变菌株Bm-rif，记录其培养性状。

1.5 抗药性标记菌株在土壤和烟叶叶面的定殖及对TMV抑制作用的测定

在灭菌和非灭菌土壤中，分别添加1%的Bm-rif发酵液并混匀，用花盆分装并植入本氏烟草，每处理4盆重复，温室培养、常规管理。分别在第0、3、10、17、24、31、38、45、52和59 d取1 g根际土壤，用20 mL无菌生理盐水振荡漂洗30 min，取100µL于含200µg/mL Rif的LA上涂板，28℃培养16 h，记录目标菌落数量［15，19］。

对两组盆栽7叶期的本氏烟草，以10 mL/株用量的发酵液进行叶面喷雾，在温度28℃、相对湿度60%～80%条件下培养。一组分别在第0、3、8、13、18、23和30 d随机剪取5 g叶片，漂洗后取100µL于含200µg/mL Rif的LA上涂 布平板，测定目标菌量。另一组于叶面喷施发酵液1 d后，摩擦接种TMV-GFP，对照植株喷施含200µg/mL Rif的LB，并测定抑制效果。

1.6 Bm发酵液对烟草黑胫病和青枯病田间防治效果的测定

Bm发酵液用水稀释至活菌数量106～108cfu/g，黑胫病对照药剂为1%申嗪霉素悬浮剂500倍液，青枯病对照药剂为3×1011cfu/g荧光假单胞杆菌可湿性粉剂150倍液，清水为空白对照。移栽时开始施药，共施药2次，施药间隔期7 d，施用方式为喷淋茎基部，50 mL/株。每处理25株，重复4次。于末次施药后10 d对烟株进行病情调查，并统计病情指数和防治效果［20］。

2 结果与讨论

2.1 Bm发酵产物对TMV、黑胫病菌和青枯病菌的抑制效果

对TMV的半叶法生物测定结果（图1）显示，接种后3 d，对照的枯斑数目显著多于发酵液或发酵上清液处理（图1A）。对黑胫病菌的对峙培养结果（图1B）显示，培养7 d，对照平板已长满菌丝，而Bm无菌发酵上清液处理病原菌菌丝沿滤纸方向菌丝生长明显被抑制。涂布青枯病菌并放置拮抗菌滤纸片培养2 d，对照平板长满病原菌，而Bm无菌发酵上清液的处理沿滤纸片周围产生明显的抑菌圈（图1C）。

图1 Bm发酵产物对烟草花叶病毒、烟草黑胫病菌和青枯病菌的抑制效果Fig.1 Inhibition effects of Bm fermentation product on TMV,Phytophthora parasitica var.Nicotianae and Ralstonia solanacoarum

表1结果显示，Bm发酵液对TMV的抑制效果为88.4%，发酵上清液对TMV的抑制效果为74.3%，略低于发酵液。Bm无菌发酵上清液对黑胫病菌的菌丝生长抑制率为67.5%，对青枯病菌的抑菌圈直径为10.0 mm。

表1 生防菌Bm发酵产物对TMV、黑胫病菌和青枯病菌的抑菌活性Tab.1 Antimicrobial activities of biocontrol bacterium Bm against TMV,Phytophthora parasitica var.nicotianae and Ralstonia solanacoarum

生物测定试验结果显示，Bm发酵产物能抑制TMV、黑胫病菌和青枯病菌；其作用机制主要是拮抗作用，即Bm发酵产物通过体外钝化TMV而减少初侵染，对黑胫病菌和青枯病菌主要表现为生长抑制。但其具体活性成分尚未确定，菌株发酵液对TMV的抑制效果高于离心去菌体后的发酵上清液，说明活菌对TMV的拮抗效果更好。鉴于芽胞杆菌产生活芽胞，抗逆性强［1-2］，开发应用中应优先考虑使用活菌制剂。

2.2 抗药性标记菌株Bm-rif的性状分析

生防菌发挥促生防病作用的关键是能在作物根际稳定定殖。通常采用构建荧光蛋白GFP标记的重组菌株，或筛选对Rif有抗性的驯化菌株，并开展定殖能力的检测［21-22］。经系列浓度Rif抗性诱导，获得可稳定生长的抗性标记菌株Bm-rif。平板培养结果（图2）显示，Bm-rif生长性状与野生型菌株Bm之间无差异，因此可用于定殖能力的检测。

图2 Bm菌株的单菌落形态Fig.2 Morphology of single colony of Bm strain

2.3 菌株Bm-rif在烟草根际土壤和叶面上的定殖及对TMV的抑制效果

温室定殖试验结果（图3）显示，在非灭菌土壤中Bm-rif初始菌量为130.00×105cfu/g，培养第3天下降至44.12×105cfu/g，第45天后趋于稳定，种群数量为0.04×105cfu/g。在灭菌土壤中Bm-rif初始菌量为380.00×105cfu/g，培养第3天为360.00×105cfu/g，随后下降，培养第17天降至与非灭菌土相近数量级并上下波动，但仍显著高于非灭菌土壤，最终种群数量为0.47×105cfu/g。从初始添加和最终定殖的菌量水平分析，Bm更易在灭菌土壤中定殖，可能是非灭菌土中的微生物自然种群丰富，对添加的外来菌株有抑制作用。

图3 Bm-rif在烟草根际土壤和叶面上的种群动态Fig.3 Population dynamics of Bm-rif in tobacco rhizosphere soil and on tobacco leaves

在叶面上的初始菌量310.00×105cfu/g，与灭菌土壤中相近，但在培养第3天迅速下降至29.00×105cfu/g，培养第30天为0.02×105cfu/g，叶面定殖种群显著低于土壤中。喷施菌液24 h后接种TMV-GFP汁液的侵染斑统计结果（图4）显示，与喷施培养液对照相比，喷施菌液处理其斑点数显著降低，对TMV抑制率为44.04%。

图4 叶面喷施Bm-rif对TMV-GFP的抑制效果Fig.4 Inhibitory effect of Bm-rif sprayed on tobacco leaves against TMV-GFP

试验中发现喷施菌液3 d后再接种病毒，几乎无抑制效果。生防菌微菌落在植物表面定殖形成生物膜，是发挥抑菌作用的重要机制［23］。Bm菌液在叶面上附着，对TMV具有钝化和抑制初侵染的作用；当定殖菌量处于较低水平时，则失去拮抗效果。

2.4 Bm发酵液对烟草黑胫病和青枯病的田间防治效果

田间防治效果试验结果（表2）显示，末次施药后10 d，以Bm处理的烟株黑胫病发病率50.00%、病情指数10.23，显著低于清水对照，防治效果为68.09%。以Bm处理的烟株青枯病发病率68.59%、病情指数21.84，显著低于清水对照，防治效果为51.02%。

表2 不同处理对烟草黑胫病和青枯病的田间防治效果Tab.2 Control effects of different treatments on black shank and bacterial wilt in tobacco fields

菌株发酵液稀释施用两次后，前期观察到对烟株有一定的促生作用，未观察到毒害症状，这与前期室内促生试验结果一致［14］。Bm主要的作用机制可能是促进植株生长而提高抗性以及在烟株茎基部定殖减少病原菌的侵染机会［1，23］。

3 结论

室内半叶法、对峙培养和抑菌圈法生物测定、叶面和根际定殖及田间防治效果试验结果表明：Bm发酵产物对烟草花叶病毒、烟草黑胫病菌和烟草青枯病菌均具有较好抑菌（毒）活性；经Rif抗性诱导获得的抗性标记菌株Bm-rif在平板上的生长性状与野生型菌株无差异。叶面喷施Bm发酵稀释液能显著抑制TMV的初侵染，根际环境更有利于菌株的定殖；烟株茎基部喷淋Bm发酵稀释液对烟草黑胫病和青枯病具有一定的预防作用。