低温刺激对不同温型香菇发酵液菌株酶活性的影响

王晓敏， 陈 旭*， 曾 茜

(1.贵州省农业科学院 农业资源与环境研究所， 贵州 贵阳 550006； 2.贵州中医药大学 基础医学院， 贵州 贵阳 550025； 3.贵州大学 农学院食用菌研究院， 贵州 贵阳 550006)

香菇(Lentinulaedodes)隶属蘑菇纲(Agaricomycetes)、蘑菇目(Agaricales)、类脐菇科(Omphalotaceae)、微香菇属(Lentinula)，是我国主要的食用菌之一[1]。香菇属低温、变温结实性菌类，香菇原基形成需要有一定的昼夜温差刺激，昼夜温差大，子实体原基数目越多。所需要的温度由香菇品系所决定。因此，温度成为影响香菇生长和品质的限制因素[2]。纤维素酶是降解基质纤维素的主要酶类，可将纤维素分解成小分子物质供菌丝体生长发育。过氧化氢酶和多酚氧化酶在木质素降解中起重要作用，其活性越强，菌株降解木质素的能力就越强[3-4]，少见低温刺激对各温型香菇发酵液菌株酶活性的影响的研究报道，探明其作用机制具有重要意义。为此，以香菇发酵液菌株为材料，研究低温刺激对不同温型香菇发酵液菌株纤维素酶、过氧化氢酶和多酚氧化酶活性的影响，为低温刺激不同温型香菇发酵液菌株酶活性变化的深入研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

香菇菌种等：高温型香菇发酵液菌株XN01和低温型香菇发酵液菌株2091，由贵州省土壤肥料研究所提供；马铃薯，购于金竹农贸市场。

试剂：葡萄糖、蛋白胨、琼脂和维生素B1，购于索莱宝；磷酸二氢钾、硫酸镁、邻苯二酚、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、柠檬酸、柠檬酸钠、3,5-二硝基水杨酸(DNS)、愈创木酚和过氧化氢，购于贵州爱瑞特生物科技有限公司。

仪器：超净工作台，苏州净化设备有限公司；培养箱和水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司；灭菌锅，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；pH计和紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1 香菇发酵液菌株的培养 液体培养基配方：每100 mL中，马铃薯20 g、葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁1 g和维生素B10.5 g，121℃灭菌30 min。2个不同温型香菇发酵液菌株分别接种至液体配方，120 r/min，25℃培养5 d，再于10℃、15℃、20℃和25℃条件刺激培养1 d。

1.2.2 粗酶液的提取 将菌丝体用RO水冲洗，滤除水分，低温烘干，取2 g干菌丝，适当研磨后移入试管中，加RP水20 mL，在水浴锅中37℃浸提2 h，定容至25 mL，4℃ 8 000 r/min冷冻离心10 min，取上清分装，于-80℃保存备用[5]。

1.2.3 酶活性测定 多酚氧化酶参照文献[6]的方法测定，在2 mL离心管中加入500 μL 0.1 mmol邻苯二酚和500 μL 0.05 mol(pH 6.0)磷酸缓冲液，加入粗酶液500 μL，28℃水浴30 min，8 000 r/min离心5 min，于 400 nm处比色，观察并记录结果。过氧化氢酶参照文献[7]方法测定，取2 mL离心管加入100 μL粗酶液，200 μL 25 mmol/L愈创木酚溶液，50 μL的0.5mol/L的过氧化氢溶液，于470 nm处比色，观察并记录结果。纤维素酶参照文献[8]的方法测定，取2 mL离心管，每个管中加入滤纸1 cm×1.2 cm，加入0.05 mol/L柠檬酸缓冲液200 μL，加入粗酶液200 μL，50℃水浴1 h，取出后加入DNS 300 μL，100℃煮沸5 min，定容至5 mL，于 520 nm处比色，观察并记录结果。

1.3数据处理

采用SPSS 21.0分析数据，并对不同样品进行差异性分析。

2结果与分析

2.1不同温度对2种香菇菌丝多酚氧化酶活性的影响

从图1看出，不同低温刺激处理下，随着处理温度的降低，高温型香菇发酵液菌株XN01和低温型香菇发酵液菌株2091多酚氧化酶活性均呈下降趋势，均以10℃最低，分别为59.3%和67.7%；25℃最高，分别为100%和93.0%；其中，当处理温度≤20℃时低温型香菇发酵液菌株2091多酚氧化酶活性一直高于高温型香菇发酵液菌株XN01。表明，低温刺激会降低香菇发酵液菌株的多酚氧化酶活性。

注：酶活性均以最高时为100%，下同。

2.2不同温度对2种香菇菌丝过氧化氢酶活性的影响

从图2看出，不同低温刺激处理下，随着处理温度的降低，高温型香菇发酵液菌株XN01和低温型香菇发酵液菌株2091过氧化氢酶活性均呈降低趋势，均以10℃最低，分别为48.3%和45.2%；25℃最高，分别为100%和94.6%。其中，2个香菇发酵液菌株过氧化氢酶活性除15℃时相近外，其余温度下低温型香菇发酵液菌株2091过氧化氢酶活性一直高于高温型香菇发酵液菌株XN01。经方差分析，25℃处理香菇发酵液菌株过氧化氢酶活极显著高于10℃、15℃和20℃。

图2不同温度刺激培养2个香菇液体菌株的过氧化氢酶活性

2.3不同温度对2种香菇菌丝纤维素酶活性的影响

从图3看出，不同低温刺激处理下，随着处理温度的降低，高温型香菇发酵液菌株XN01和低温型香菇发酵液菌株纤维素酶活性均呈下降趋势，相同温度刺激下，高温型香菇发酵液菌株XN01纤维素酶活性均高于低温型香菇发酵液菌株2091，2个香菇发酵液菌株纤维素酶活性均以10℃最低，分别为83.2%和74.2%；25℃最高，分别为100%和96.1%。可见，低温刺激会降低香菇发酵液菌株纤维素酶的活性。

图3不同温度刺激培养2个香菇液体菌株的纤维素酶活性

3小结

研究结果表明，10℃、15℃、20℃和25℃条件刺激培养1 d，随着处理温度的降低，2个香菇发酵液菌株多酚氧化酶、过氧化氢酶和纤维素酶活性均呈下降趋势，说明低温环境下酶促反应降低。其中，当处理温度≤20℃时低温型香菇发酵液菌株2091多酚氧化酶活性一直高于高温型香菇发酵液菌株XN01，表明高温型香菇发酵液菌株XN01的多酚氧化酶活性对温度更敏感；2个香菇发酵液菌株过氧化氢酶活性除15℃时相近外，其余温度下低温型香菇发酵液菌株2091过氧化氢酶活性一直高于高温型香菇发酵液菌株XN01；相同温度刺激下，高温型香菇发酵液菌株XN01纤维素酶活性均高于低温型香菇发酵液菌株2091。总体看，不同温型香菇发酵液菌株的酶活性对低温刺激的响应强度不同，高温型菇不宜用过低温度对其进行刺激。