烟草根细胞原生质体的制备

翟妞，徐国云，张慧，郑庆霞，陈千思，刘萍萍，王晨，金立锋，周会娜

中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

植物原生质体是去除细胞壁后被质膜包被的活性细胞，广泛应用于细胞工程和分子生物学研究，如作物改良［1］、突变体创制［2］、基因亚细胞定位［3］和基因沉默与基因编辑［4-5］等。近年来，随着植物单细胞组学的快速发展，植物原生质体尤其是拟南芥根原生质体作为组织特异的材料［6-7］被广泛应用于植物单细胞基因组、转录组、蛋白质组以及代谢组学的研究中［8-9］，为植物生长发育和抗胁迫研究提供了新思路。高活性的原生质体是细胞水平组学分析的基础，因此植物原生质体制备技术愈来愈被重视。现有植物组织原生质体制备方法主要有机械法、化学法和酶解法，其中酶解法是最有效快速分离原生质体的方法［10］。烟草作为主要的模式植物之一，对植物学的研究具有重要意义。目前有关烟草组织原生质体的制备方法，常见的主要是叶肉细胞的分离［11-12］，而烟草根尖原生质体的制备则鲜见文献报道。根是烟草吸收营养元素的关键部位，也是生物碱的合成场所，建立有效的烟草根原生质体的制备方法，对在细胞水平上研究烟草营养和生物碱代谢具有重要意义。为此，以本氏烟草和栽培烟草K326为材料，利用酶解法制备了烟草根原生质体，并通过优化酶解液组合、酶解时间和酶解渗透压等条件，获得了较高活性和数量的根原生质体，旨在为烟草基因功能的验证以及单细胞组学的研究提供材料。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 烟草根材料

培养皿点种的烟草（本氏烟草和栽培烟草K326）根，光照培养箱中培育，每天12 h光照（28℃）、12 h黑暗（25℃）处理；7 d时，采集离根尖0.5 cm的根，去离子水冲洗3次，置于冰上预冷的培养皿中备用。

1.1.2 试剂

纤维素酶R-10、果胶酶Y-23和离析酶R-10（日本Yakult公司）；甘露醇（美国Amresco公司）；甘油和0.4%台盼蓝溶液［生工生物工程（上海）股份有限公司］；牛血清白蛋白BSA（美国Sigma公司）；其他常规试剂均为中国医药集团有限公司试剂。原生质体裂解缓冲液为实验室自配（0.3～0.5 mol/L甘露醇，10 mmol/L KCl，10 mmol/L CaCl2和0.1%BSA）。

1.1.3 仪器

电子天平（PL-602L，瑞士Mettler Toledo公司）、超纯水一体化系统（PURELAB Pulse，英国ELGA公司）、冷冻台式离心机（FRESCO 21，美国Thermo公司）、植物光照培养箱（E-36L2，美国Percival公司）、恒温摇床（770R，美国APLUS公司）、pH计（S210-K，瑞士Mettler Toledo公司）、细胞计数仪（TC20，美国Bio-Rad公司）、倒置显微镜（DWI400，德国Leica公司）。

离心管（美国Thermo公司）；10 cm植物培养皿［生工生物工程（上海）股份有限公司］；手术刀片［生工生物工程（上海）股份有限公司］；移液管（美国Thermo公司）；40µm细胞筛（美国Corning公司）；细胞计数板（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 根尖细胞的酶解法分离

参考Zhang等［13］的方法制备根尖细胞，并作优化处理。具体方法：将生长7 d左右的烟草根用无菌水清洗3次，滤纸吸干，沿根尖方向刀片切取0.5 cm。将处理后的根置于50 mL离心管中加入配制好的酶解液10 mL，以50 r/min、28℃条件下避光振荡处理1～5 h。裂解结束后，将酶解液过直径40µm细胞筛，收集滤液。以500 r/min离心10 min，去除上清液。以8%Mannitol悬浮，500 r/min离心5 min，重复3～4次。缓冲液重新悬浮，即为根尖细胞原生质体。

1.2.2 原生质体数量与活性分析

参考Kang等［14］的方法进行原生质体计数及活性检测，并作适当调整。具体操作：取原生质体悬液20µL，加20µL台盼蓝溶液混匀，静置10 s。将10μL原生质体悬液加入细胞计数板中，静置30 s，插入细胞计数器计数，读取细胞密度D（个/mL）并计算成活率。每个样本设置3次重复。计算公式：

1.2.3 荧光显微镜观察原生质体

参考聂琼等［12］的方法于显微镜下观察原生质体。具体操作：直接吸取酶解过程中的根尖细胞原生质体悬浮液，于6孔板中在倒置显微镜下进行观察。设置不同时间，每隔1 h倒置显微镜观察1次。观察时先在低倍镜下找到原生质体后更换高倍镜观察，上下调动细螺旋，以便看到清晰透亮原生质体细胞，并同时拍照记录原生质体的实时状态。根尖细胞裂解结束后，吸取10μL原生质体悬液，经台盼蓝染色后滴于载玻片上，盖上盖玻片，倒置显微镜观察原生质体状态，并拍照记录。

2 结果与分析

2.1 不同酶组分对根尖原生质体分离的影响

依据其他植物（拟南芥、水稻等）根原生质体的制备方法［13，15-16］，对不同的裂解酶组合裂解本氏烟草根尖进行考察。结果发现，经过相同时间，与离析酶+纤维素酶的组合相比，果胶酶+纤维素酶的组合裂解烟草根尖更容易获得原生质体（图1A），且效率更高；而对于酶浓度的考察，相对于1.0%果胶酶和1.0%纤维素酶组合，1.5%果胶酶和1.5%纤维素酶组合能获得更多的原生质体（图1B）。因此，对于烟草根尖原生质体的制备，1.5%果胶酶和1.5%纤维素酶组合更有效。

图1 不同裂解酶组分下的原生质体状态Fig.1 Morphology of protoplasts with different lyase combinations

2.2 渗透压对根尖原生质体分离的影响

利用1.5%果胶酶和1.5%纤维素酶组合，通过不同浓度的甘露醇（0.2～0.5 mol/L）调节裂解液的渗透压，酶解本氏烟草根尖3 h，并对获得的根尖原生质体进行细胞计数和活性检测。结果发现，随着甘露醇浓度的增加，根尖原生质体数量先增加后减少，尤其是甘露醇达0.5 mol/L时，根原生质体数量急剧降低（图2A）；但是随着甘露醇浓度的增加，尤其是甘露醇浓度由0.3 mol/L到0.4 mol/L时，原生质体的活性由25%急速增加到63%，而甘露醇达0.5 mol/L时却略有降低。因此烟草根尖原生质体裂解时，甘露醇适宜浓度为0.4 mol/L。

图2 不同渗透压下的原生质体产量和活性比较Fig.2 Yields and vitalities of protoplasts under different osmotic pressures

2.3 酶解时间对根尖原生质体分离的影响

利用优化的裂解酶和甘露醇组合，酶解本氏烟草根尖1～3 h，显微镜观察结果如图3所示：随着酶解时间的增加，1 h时烟草根尖细胞原生质体成团聚集、2 h时逐渐分离、3 h时形成单细胞悬液，且2 h和3 h时原生质体状态饱满。因此，烟草根尖细胞原生质体的较适宜解离时间为2～3 h。

图3 不同酶解时间的原生质体状态Fig.3 Morphology of protoplasts under different enzymatic hydrolysis durations

同时对不同裂解时间获得的根原生质体进行计数和活性检测，结果如图4所示。随着酶解时间的增加，原生质体的产量逐渐增加（图4A）；而原生质体的活性，随着酶解时间的增加，成活率先增加后降低，2 h时的活性最高，达到70%。可见，依据根尖原生质体的产量和成活率，合适的酶解时间为2 h。

图4 不同酶解时间的原生质体产量（A）和活性（B）Fig.4 Yields（A）and vitalities（B）of protoplasts under different enzymatic hydrolysis durations

2.4 不同烟草品种对根尖原生质体分离的影响

利用优化的方法分别裂解K326和本氏烟草的根尖，对获得的原生质体进行台盼蓝染色和细胞计数仪计数，同时进行显微镜检测。结果发现，同样裂解条件下，本氏烟草根尖原生质体的活性较高、碎片较少（图5A），K326根原生质体的活性较低、碎片较多（图5B）。而同样裂解条件下，获得的K326和本氏烟草的根尖原生质体数量相当，均达到105数量级。

图5 不同烟草品种根尖原生质体的活性检测Fig.5 Vitalities of root tip protoplasts of different tobacco varieties

3 讨论

影响植物组织原生质体分离制备的因素很多，其中裂解酶的组合与浓度、裂解液渗透压和裂解时间等因素的影响最大［17-18］。因此对于烟草根尖原生质体的制备，重点考察这三方面的因素。通常烟草原生质体主要指烟草叶肉原生质体，烟草根尖原生质体涉及很少，主要原因是烟草根原生质体制备困难。

与烟草叶肉原生质体制备比，根尖原生质体制备的难点：①尽管烟草叶肉和根原生质体制备都首选酶解法，但是裂解酶的组合不同（叶肉常用纤维素酶+离析酶，根选用纤维素酶+果胶酶），并且根原生质体制备裂解酶的浓度远高于叶肉［6，11］。主要源于烟草根的纤维化程度高，纤维素含量高。②烟草根原生质体制备取材受限较大。根原生质体的制备只能采用组培或者水培几天的根尖（此时根尖纤维化程度相对较低），能够获得原生质体的数量也少；而叶肉原生质体制备可以选取大田、温室、水培、组培等苗期烟叶，能够获得的叶肉原生质体数量几乎没有限制［19］。

由于烟草根尖分化程度低且细胞质体含量极低，因此烟草根原生质体是细胞诱导分化、单细胞组学等研究的极佳材料。本研究中通过优化裂解酶组合及作用浓度、裂解渗透压及裂解时间，能够获得活性大于70%、数量达到105数量级的烟草根原生质体。与其他物种相比，烟草根原生质体的活性相对较低，为此，应进一步调整优化裂解酶组合和裂解时间，以获得活性大于90%的根原生质体，满足烟草细胞组学研究更深层次的需求。

4 结论

烟草根原生质体制备的适宜条件：材料为培养皿中点种7 d的无菌根尖；酶解液组合为1.5%纤维素酶＋1.5%果胶酶；裂解液甘露醇浓度为0.4 mol/L；裂解时间为2 h。利用优化后的分离方法，可以获得活性大于70%、数量达到105数量级的较高质量的烟草根原生质体。