外源酶制剂对雪茄茄芯烟叶化学成分和感官品质的影响

郑霖霖，赵亮，蔡兴华，段旺军，陈震，张勇刚，时向东*

1.河南农业大学烟草行业烟草栽培重点实验室，郑州市金水区农业路63号 450002 2.浙江中烟工业有限责任公司技术中心，杭州市西湖区科海路118号 310024 3.四川中烟工业有限责任公司，成都市成龙大道一段56号 610066

传统手工卷制的雪茄由茄衣、茄套和茄芯烟叶组成，其中茄芯为雪茄的主要部分，决定着雪茄吸食时的主流风味特征［1］。除栽培和调制等技术之外，发酵也是提高雪茄茄芯烟叶品质的关键措施之一［2］。烟叶发酵分为一次发酵和二次发酵，其中一次发酵主要是促进烟叶内在成分的快速转化，二次发酵主要是弥补初次发酵中的不足，使烟叶化学成分更加协调，提高烟叶品质［3］。前人研究表明，在雪茄烟叶发酵过程中添加微生物菌剂、酶制剂或其他发酵介质等可改善烟叶品质，提高烟叶工业可用性［4-6］。有研究发现酶在烟叶发酵过程中具有重要作用，酶可以催化烟叶中的某些物质分解或合成，进而提高烟叶化学成分协调性，改善烟叶吸食品质［7-8］。目前利用外源酶制剂改善烟叶品质的研究报道较多。寇明钰等［9］研究发现，在雪茄茄芯烟叶发酵过程中添加蛋白酶可降低烟叶蛋白质含量，香气质和燃烧性等得到明显改善。阮祥稳等［10］试验发现，利用纤维素酶和蛋白酶处理可缩短烟叶发酵周期，提高烟叶总糖含量，且香气量明显增加。胡捷等［11］研究表明，在烟叶发酵过程中添加氧化酶有利于降低烟叶淀粉含量，改善烟叶燃吸时的口感。夏炳乐等［12］研究认为，复合酶制剂处理的烟叶总氮和烟碱含量有所降低，香味物质总量增加，感官品质明显提高。说明添加外源酶能明显改善烟叶香气和吸味，提高烟叶燃烧性，烟叶化学成分含量及比值趋于协调［13］。而目前的研究主要涉及烤烟及未发酵雪茄烟叶中添加外源酶制剂，在雪茄茄芯烟叶二次发酵中添加外源酶制剂的研究则较少。为此，基于四川什邡雪茄茄芯烟叶初次发酵后蛋白质含量较高、刺激性较大等特点，以初次发酵的德雪1号中部烟叶为研究对象，在二次发酵前添加不同浓度的植酸酶、纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶制剂，研究外源酶制剂对二次发酵雪茄茄芯烟叶化学成分和感官品质的影响，旨在为提高烟叶使用价值、改进雪茄茄芯烟叶的二次发酵工艺提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2021年在河南农业大学烟草行业烟草栽培重点实验室进行，试验材料为四川长城雪茄烟厂库存的2020年产初次发酵后的德雪1号中部烟叶。试验前先将烟叶回潮至含水率为23%左右，备用。试验用外源酶试剂：植酸酶（50 000 U/g，山东隆科特酶制剂有限公司）；纤维素酶（10 000 U/g，上海麦克林生化科技有限公司）；果胶酶（30 000 U/g，上海麦克林生化科技有限公司）；中性蛋白酶（20 000 U/g，北京索莱宝科技有限公司）。

1.2 试验设计

试验设置添加4种外源酶处理，每种酶分别设置3个用量水平，以蒸馏水为对照，共13个处理，见表1。试验前对烟叶进行回潮，烟叶含水率控制在26%±1%，而后用小型喷雾器（郑州博祥生物科技有限公司）将配制好的酶制剂均匀喷洒在烟叶表面，对照为等量蒸馏水，将喷洒过的烟叶置于KBF 240恒温恒湿柜（德国Binder公司）中进行二次发酵。发酵条件：温度45℃，相对湿度80%，发酵时间15 d。每个处理设置3次重复。

表1 试验设计Tab.1 Experimental design

1.3 测定项目及方法

1.3.1 化学成分测定

烟叶发酵结束后，采用半叶法，即取完整叶片的一半混合均匀后于45℃烘箱中干燥2 h，粉碎并过孔径0.25 mm筛网（60目），采用AA3型连续流动化学分析仪（天津中通科技发展有限公司）参照烟草行业标准YC/T 159—2019［14］、YC/T 160—2002［15］、YC/T 162—2011［16］、YC/T 217—2007［17］、YC/T 161—2002［18］、YC/T 249—2008［19］测定总糖、还原糖、烟碱、氯离子、钾离子、总氮和蛋白质含量（质量分数）。根据烟草行业标准YC/T 282—2009［20］测定烟叶中的氨基酸含量。

1.3.2 可用性评价

采用化学成分可用性指数（Chemical Components Usability Index，CCUI）进行化学成分评价［21］，依据隶属度函数模型指数和法计算CCUI：

式中：j为参评指标；i为不同酶处理；f（x）为隶属度函数；w为各参评指标的权重。

选取总糖、还原糖、烟碱、总氮、钾离子、氯离子、氮碱比和钾氯比8个指标作为评价各处理化学成分的可用性因子。参照文献［22-23］选择抛物线型（P型）作为总糖、还原糖、烟碱、总氮、氯离子和氮碱比的隶属度函数，函数表达式为：

选择S型作为钾离子和钾氯比的隶属度函数，函数表达式为：

式中：x为各化学成分指标的实际数值；x1、x2、x3、x4分别代表各化学成分指标的下限临界值、最优下限值、最优上限值和上限临界值，取值参照古巴雪茄烟叶各化学成分指标的实测值以及文献［24-27］确定，见表2。运用主成分分析法并结合专家意见，对样品数据进行分析，计算得到各评价指标的权重值［28］。

表2 雪茄茄芯烟叶化学成分指标的隶属函数类型、拐点值及权重Tab.2 Function types,inflection points and weights of chemical component indexes of tobacco leaves for cigar fillers

1.3.3 感官品质评价

将发酵后的另一半烟叶由同一人员手工卷制成长度110 mm，直径14 mm的雪茄烟，在温度18℃、相对湿度70%的恒温恒湿柜中醇化养护4个月后供评吸使用。由国家烟草栽培生理生化研究基地组织6名具有行业感官评吸资质的评委完成评吸，采用湖北中烟工业有限责任公司三峡卷烟厂雪茄原料9分制评吸方法，对烟叶香气质、香气量、余味、杂气、甜感、刺激性、燃烧性和灰色8个指标进行感官品质评价，并分别赋予18%、16%、16%、10%、10%、12%、10%和8%的权重，按照公式（4）计算总分，总分越高代表烟叶的感官品质越好。评价方法见表3。

表3 雪茄原料感官品质评价方法Tab.3 Evaluation methods for sensory quality of cigar raw materials

式中：T为感官品质评价得分；Pi为某单项指标权重；为某单项指标平均得分。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2010软件进行数据处理及绘图；采用SPSS 22.0软件进行差异显著性检验（Duncan's法）。

2 结果与分析

2.1 外源酶制剂对雪茄茄芯烟叶常规化学成分及氨基酸含量的影响

由表4可知，与CK相比，T2和T3处理雪茄茄芯烟叶总糖和还原糖含量增加至适宜范围内或接近适宜范围，且糖含量随着酶浓度的增加整体呈增加趋势。而T1和T4处理烟叶总糖和还原糖含量与CK相比差异不显著。喷施酶制剂后烟叶烟碱含量在2.00%～2.43%之间，较CK降低4.33%～21.26%。不同酶制剂均以120 U/g酶浓度处理烟叶烟碱含量最低，且T1A3处理与T2A3、T3A3、T4A3处理间差异显著。与CK相比，T2处理烟叶总氮含量均下降至适宜范围内，较CK降低3.85%～10.34%，且不同酶用量处理间差异显著。T4处理烟叶总氮含量随着酶用量的增加呈上升趋势，以T4A3处理烟叶总氮含量最高，较对照显著增加3.85%。T1和T3处理则相反，烟叶总氮含量随着酶用量的增加逐渐降低，其中T1A3和T3A3处理烟叶总氮含量较CK显著降低，且均处于适宜范围内。与CK相比，不同酶制剂处理（T3A1除外）烟叶蛋白质含量均明显降低，以T4A2处理最低，较CK降低13.66%。氨基酸含量则明显增加，且T3和T4均以90 U/g酶用量的处理烟叶氨基酸含量最高，与CK相比提高17.57%和21.28%。不同外源酶处理烟叶中钾含量较CK均增加至适宜范围内，增幅为0.72%～13.77%。不同酶制剂同一酶用量条件下，T4处理烟叶钾含量显著高于其他处理。不同酶制剂处理烟叶氯含量之间无显著差异，均处于或接近适宜范围（0.60%～0.80%）内。

表4 不同外源酶处理对雪茄茄芯烟叶化学成分含量的影响①Tab.4 Effects of different exogenous enzyme treatments on contents of chemical components in tobacco leaves for cigar fillers

2.2 雪茄茄芯烟叶化学成分可用性评价

CCUI值越高，表明烟叶化学成分整体协调性越好，烟叶可用性较高［28］。由图1可知，与CK相比，T2和T3处理雪茄茄芯烟叶CCUI值均有所增加，其中以T3A3处理烟叶CCUI值最高，较CK增加21.21%；T1A1、T1A2和T4A1处理烟叶CCUI值显著增加，而T1A3、T4A2和T4A3处理则明显降低，以T4A3处理的CCUI值最低，较CK降低13.64%。与CK相比，不同酶制剂中均以60 U/g酶用量处理的烟叶CCUI值显著提高，比CK增加9.09%～21.21%。

图1 不同外源酶处理雪茄茄芯烟叶化学成分可用性指数Fig.1 Usability indexes of chemical components in tobacco leaves for cigar fillers under different exogenous enzyme treatments

2.3 外源酶制剂对雪茄茄芯烟叶感官品质的影响

由表5可知，添加酶制剂进行二次发酵后，雪茄茄芯烟叶的感官品质评价总分均高于CK。但不同酶处理间存在一定差异。整体来看，T1A3处理的烟叶评吸总分最高，感官品质较好，表现为香气质较好、香气量充足、余味较舒适、杂气微显、刺激性微有、烟气柔和细腻。T2A3处理次之，T1A1处理的烟叶感官品质评分最低，表现为刺激性较大、灰色偏黑。在同种酶处理下，评吸总分随着酶用量的增加而增加，烟叶香气质改善、香气量增加、余味舒适、甜度明显提高，杂气和刺激性降低。因此，以T1A3和T2A3处理的效果最好，香气和综合品质均表现最优。

表5 不同外源酶处理雪茄茄芯烟叶的感官品质评价Tab.5 Sensory quality evaluation of tobacco leaves for cigar fillers under different exogenous enzyme treatments（分）

3 讨论

烟叶化学成分是烟叶品质的内在表现，直接影响烟叶的感官品质［29］。本研究结果表明，纤维素酶和果胶酶处理可显著增加二次发酵后雪茄茄芯烟叶总糖和还原糖含量，这与李国栋等［30］研究结果一致，其原因可能是纤维素酶与果胶酶属于多糖水解酶，可水解纤维素和果胶等物质，进而增加了烟叶中可溶性总糖含量。此外，研究中还发现纤维素酶可显著降低二次发酵后雪茄茄芯烟叶烟碱含量，这与吴薇［31］、陈洪等［32］的研究结果一致，可能是因为纤维素酶破坏了烟叶细胞壁结构，细胞的渗透阻力降低进而引起烟叶内含物质的渗出，烟碱含量相对降低［33］。添加中性蛋白酶进行二次发酵后，雪茄茄芯烟叶中总氮含量略有增加，蛋白质含量明显降低，氨基酸含量明显增加，这与王林等［34］研究的不同酶制剂对烤烟上部叶化学成分影响的结果一致，可能是由于中性蛋白酶本身也为蛋白质，经过酶解后烟叶中蛋白质氮含量降低，但总氮含量略有增加所致［35］。钾、氯含量以及钾氯比与雪茄烟叶燃烧性密切相关，燃烧性差的烟叶其内含物质无法充分分解，会产生令人不愉快的枯焦气味。本研究中发现，添加外源酶制剂进行二次发酵后雪茄茄芯烟叶钾含量明显提高，钾氯比有所增加，可能是因为添加外源酶制剂后，氨气等气体物质在二次发酵过程中大量逸出挥发导致干物质量降低。

烟叶各化学成分指标之间是相互影响、相互作用的，通过CCUI值可比较烟叶常规化学成分的协调性［36］。本研究结果表明，外源酶处理可提高二次发酵后雪茄茄芯烟叶CCUI值与感官品质评价总分，其中纤维素酶和果胶酶处理烟叶CCUI值与感官品质变化规律基本一致，均随着酶用量的增加总体呈上升趋势，与马海燕［37］、樊文举等［38］的研究结果一致，可能是由于外源酶促进了烟叶内部物质的合成、分解与转化，进而改善烟叶化学成分的协调性，提高了烟叶感官品质。值得注意的是120 U/g植酸酶、90 U/g和120 U/g中性蛋白酶处理的烟叶CCUI值与感官品质评价出现了背离现象，其原因一方面是CCUI值受隶属函数拐点值和各指标权重值的影响［22］，另一方面是较高用量酶制剂处理的烟叶香味前体物质降解转化较为充分，进而提高了烟叶感官品质。因此，添加外源酶对二次发酵后雪茄茄芯烟叶香气品质的影响仍需进一步深入研究。而有关组合酶（纤维素酶和中性蛋白酶、植酸酶和中性蛋白酶等）之间的相互作用及其对烟叶品质的影响方面也有待进一步试验。

4 结论

在雪茄茄芯烟叶二次发酵前添加不同外源酶制剂后烟叶化学成分及感官品质存在明显差异。添加120 U/g纤维素酶和120 U/g果胶酶可显著提高二次发酵后雪茄茄芯烟叶总糖和还原糖含量，添加90 U/g植酸酶和90 U/g中性蛋白酶可显著降低雪茄茄芯烟叶烟碱和蛋白质含量，提高氨基酸含量。同等酶用量条件下，纤维素酶与果胶酶对改善二次发酵后雪茄茄芯烟叶化学成分协调性的效果优于植酸酶和中性蛋白酶。同种酶制剂条件下，高用量酶处理提高烟叶感官品质的效果优于低用量酶处理。综合考虑烟叶化学成分协调性、感官品质和实际应用成本，以120 U/g纤维素酶处理更有利于提高二次发酵后雪茄茄芯烟叶品质。