复合亚氯酸钠灭活烟草花叶病毒的机理分析

杨明明，陈泽鹏，邓海滨，沈会芳，杨祁云，林壁润，阮小蕾*

1.华南农业大学植物保护学院广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室，广州市天河区五山路483号 510642 2.中国烟草总公司广东省公司烟叶管理处，广州市天河区林和东路128号 510610 3.广东省烟草科学研究所,广东省韶关市武江区滨江路69号 512026 4.广东省农业科学院植物保护研究所广东省植物保护新技术重点实验室，广州市天河区金颖路7号 510640

由烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）引起的烟草花叶病是烟草生产上重要的病害之一，每年可造成较大的经济损失［1］。TMV的苗期感染是花叶病发生的主要因素［2］，因此选用有效的消毒剂对苗棚设施及育苗工具进行消毒是减少烟苗感染病毒的主要措施［3-6］。在前期试验中，对8种消毒剂进行了TMV、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）的消杀测试，从中筛选出消毒效果较好的复合亚氯酸钠［7］。复合亚氯酸钠消毒剂是2015年通过中华人民共和国农业农村部审批获得国家认证的三类新兽药［8］，可用于畜、禽圈舍的消毒；也可用于防治鱼、虾的细菌性疾病和病毒性疾病［9］。复合亚氯酸钠是一种稳定的二氧化氯消毒剂，其杀菌能力与纯二氧化氯消毒剂相似［9］。

TMV是一种正义单链RNA（+ssRNA）病毒，由外壳蛋白和包被于内部的链状RNA分子组成［10］。TMV基因组编码4个蛋白，大小分别为126、183、30和17.5 kDa［11］。183 kDa蛋白与126 kDa蛋白有部分密码子重叠［12］，其中重叠部分蛋白大小为54 kDa，含有复制酶（Replicase）保守序列［13］。126 kDa和183 kDa蛋白在病毒的复制过程中起催化作用，又称为RNA依赖RNA聚 合 酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）。30 kDa蛋白是运动蛋白(Movement protein，MP）［12］，17.5 kDa蛋白为病毒的外壳蛋白（Coat protein，CP）［13］。

复合亚氯酸钠遇水后释放的二氧化氯是其主要消毒成分［9］。二氧化氯对病毒的灭活机理存在不同的观点。目前消毒剂灭活病毒的机理主要从消毒剂对病毒的外壳蛋白和核酸的破坏程度两方面进行研究［14］。由于消毒对象、消毒剂的种类、浓度、消毒条件或检测方法的不同造成研究结果不一致［15］。Alvarez等［16］发现，二氧化氯灭活的脊髓灰质炎病毒（Poliovirus，PV）1型仍能够感染宿主细胞，并能脱衣壳；而氯灭活的PV1丧失了感染细胞的能力，但核酸结构仍然完整。由此认为二氧化氯主要通过损伤病毒的基因组来灭活病毒；氯主要通过破坏病毒衣壳蛋白而灭活病毒［17］。Li等［18］试验认为，二氧化氯和氯灭活甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus，HAV）后其外壳蛋白结构完整，可以被检测到，表明二氧化氯主要通过破坏病毒核酸来灭活HAV。赵祖国［15］通过对二氧化氯和氯灭活PV后病毒基因组的破坏情况进行分析，发现二氧化氯和氯均是通过破坏病毒核酸来灭活PV的。对PV的致死性损伤位点均位于病毒基因组的5’端的非编码区内，但二者在损伤基因的具体位点上存在差异［15］。刘艳芝［19］分析了二氧化氯灭活水中肠道腺病毒41型的病毒核酸和衣壳蛋白被破坏的情况，发现二氧化氯灭活病毒时核酸损伤先于衣壳蛋白，衣壳蛋白损伤与病毒感染性消失不相关。单金洋［20］研究了二氧化氯灭活肠道病毒71型的病毒感染性消失与病毒基因组结构损伤的关系，发现5′-NTR区域的1～118 nt损伤导致病毒感染性消失。Nuanualsuwan等［21-23］研究发现，用氯或紫外线对PV1进行灭活时，对病毒衣壳蛋白的损伤是这两种消毒方式灭活病毒的主要机制。有关二氧化氯在烟草生产中用于消毒剂的报道较多［24-25］，但二氧化氯灭活TMV的机理尚鲜见报道。为此，采用实时定 量RT-PCR（Real time Quantitative RT-PCR，qRT-PCR）、间接酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等技术综合分析了复合亚氯酸钠对TMV相关基因的表达、外壳蛋白结构、病毒粒子侵染活性及整体结构的影响，旨在明确复合亚氯酸钠灭活TMV的机理。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试毒源及抗血清供试病毒：TMV（普通株系）保存在普通烟草（Nicotiana tabacum）上，由华南农业大学植物病毒研究室提供。TMV特异性抗血清由华南农业大学植物病毒研究室提供。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G购自北京鼎国生物技术有限公司。

1.1.2 枯斑寄主

心叶烟（N.glutinosa）由华南农业大学植物病毒研究室提供。

1.1.3 供试药剂

复合亚氯酸钠由广东省农科院植保所提供，用清水配成浓度为500 mg/L。中和剂为1%（质量分数）硫代硫酸钠+l%（质量分数）卵磷脂+1%（质量分数）Tween80/PBS，均购自河南省新乡市康大消毒剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 感染病毒烟草组织总RNA的提取

采用植物组织RNA提取试剂盒（宝生物工程大连有限公司）提取烟草总RNA。

1.2.2 引物的设计与合成

根据已报道的TMV Longlin-2（GENBANK：HE818434.1）的基因序列，采用引物设计软件Vector NT1 explorer、Primer 5.0和Oligo设 计PCR扩增 引物。引物由宝生物工程大连有限公司合成。普通PCR引物信息见表1，实时荧光定量PCR引物信息见表2，大片段步移RT-PCR引物信息见表3。

表1 普通RT-PCR引物信息Tab.1 Primer information of RT-PCR

表2 qRT-PCR引物信息Tab.2 Primer information of qRT-PCR

表3 TMV基因组大片段步移RT-PCR引物信息Tab.3 Primer information of large segment step RT-PCR for TMV genome

1.2.3 一步法RT-PCR反应

以抽提的待测植物组织样品的总RNA为模板，采用上述设计引物及Vazyme HiScriptⅡOne Step RT-PCR Kit一步法试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）进行RT-PCR检测。反应体系为：RNase free ddH2O 17.5μL，2×One Step Mix 25μL，One Step Enzyme Mix 2.5μL，Forward Primer(110μmol/L)2μL，Reverse Primer(10μmol/L)2μL，模板RNA 1μL，共50μL。一步法RT-PCR反应程序：50℃30 min；94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s,35个循环；72℃10 min，4℃保存。RT-PCR反应结束后，每个样品取5µL扩增产物，与1µL 6×Loading Buffer混匀后在1%（质量分数）琼脂糖凝胶上电泳，100 V 30 min，在UVP凝胶成像系统中观察并记录。

1.2.4 TMV质粒标准品的制备与标准曲线绘制

使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（美国GenStar公司）对RT-PCR产物进行纯化回收。与pMDTM18-T载体（宝生物工程大连有限公司）进行连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。获得的候选转化子抽提质粒进行双酶切鉴定。将TMV CP和TMV Rep的重组质粒按1×10、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107和1×108稀释成8个梯度，并分别将其作为荧光定量PCR的模板进行扩增，得到溶解曲线和扩增曲线，以稀释的质粒对应拷贝数的对数作为横坐标、CT值作为纵坐标制作标准曲线，并将样品的CT值代入标准曲线方程即得到样品拷贝数的对数。

1.2.5 病毒样本处理及qRT-PCR检测

取1 g感染了TMV且症状明显的烟草叶片，加50 mL去离子水和适量23μm金刚砂充分研磨并用灭菌纱布过滤，取上清液，即为病毒液。经检测，病毒液中TMV含量为3.72×1010copies/μL。

复合亚氯酸钠（500 mg/L）与病毒液混合后分别处理15、30、45和60 min，对照为清水。对处理后的病毒液进行CP和Rep表达量检测。操作方法：采用反转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）HiScript®Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录，获得cDNA。反应体系：2×RT Mix 10μL，HiScriptⅡEnzyme Mix 2μL，Random hexamers（50 ng/μL）1μL，Oligo（dT）23VN（50μmol/L）1μL，RNA 1μL，ddH2O 5μL，共20μL。反转录反应程序：25℃5 min；50℃15 min；85℃2 min。

以反转录反应产物cDNA作为模板进行qRT-PCR，使 用SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）试 剂盒（日 本TaKaRa公 司）对qRT-PCR反应体系进行扩增。反应体系：SYBR Premix Ex TaqⅡ12.5μL，Forward Primer（10μmol/L）1μL，Reverse Primer（10μmol/L）1μL，cDNA模板2μL，灭菌水8.5μL，共25μL。反应程序：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，40个循环；溶解曲线：95℃15 s，60℃30 s，95℃15 s。

1.2.6 TMV CP的抗原破坏性测定

用复合亚氯酸钠（500 mg/L）分别对1.2.5节制备的病毒液处理15、30、45和60 min，处理结束后分别在处理液中加入适量中和剂中和。取中和后的病毒液200μL用间接ELISA检测TMV CP的破坏程度（即抗原破坏性检测）。每处理分别检测6个样品，每个样品重复3次，取平均吸光度值（OD值）。以药剂与中和剂反应产物作为阴性对照，以中和产物加毒源作为阳性对照，以清水作为空白对照。

采用间接ELISA分析TMV CP的抗原活性［26］。判断方法：用BIO-RAD酶标仪检测在492 nm波长下各样品的OD值。用试验组OD（S）值与阴性对照OD（N）值的比值来判断TMV的抗原破坏性。当S/N≥2.1时，结果为阳性，即CP结构完整，没有被破坏；＜2.1为阴性，即CP结构被破坏，不能检出。

1.2.7 TMV的侵染活性测定

病毒接种及枯斑统计：以制备的TMV病毒液作为接种液。将复合亚氯酸钠药液与TMV接种液等量混合，室温分别处理15、30、45和60 min后以半叶法摩擦接种枯斑寄主心叶烟，每处理接种6株。接种前喷洒适量金刚砂于叶片表面，每片叶的左半叶接种去离子水处理的TMV接种液（对照），右半叶接种经药剂处理的TMV病毒液。每半片叶接种200 μL，接种后清水喷雾冲洗叶面，重复3次。接种后5～7 d统计枯斑数（取6片半叶的平均值），并计算枯斑的抑制率。

1.2.8 TMV相应基因片段的损伤检测

用复合亚氯酸钠分别对制备的病毒液处理15、30、45和60 min。将处理后的病毒液采用半叶接种法分别摩擦接种于健康烟株上，以未处理的病毒液为对照。接种后1周，分别用引物对T1～T6（表3）进行大片段步移RT-PCR检测，分析接种植株不同部位TMV基因组片段的损伤情况。引物对扩增TMV基因片段见图1，其扩增区域分别为T1：183kDa-1；T2：183kDa-2；T3：183kDa-3；T4：183kDa-4；T5：54 kDa；T6：CP&MP。接种叶片及取样点见图2，每处理分别取6个点，分别为对照叶、接种叶叶脉、接种叶叶柄、茎、接种叶上部叶片、接种叶下部叶片，用于RT-PCR检测。

图1 大片段步移RT-PCR扩增TMV基因区域Fig.1 Amplification of TMV gene regions by large step RT-PCR

图2 复合亚氯酸钠处理病毒液接种及取样部位Fig.2 Inoculated locations with poisonous fluid of compound sodium chlorite and sampling locations of tobacco

1.2.9 TMV病毒提纯与处理

参照Gooding等［27］的方法进行TMV的提纯。用复合亚氯酸钠分别对病毒提纯液进行混合处理1.0 h和1.5 h，以未经过处理的病毒提纯液为对照。

1.2.10 TMV电镜观察

将对照和经过消毒剂处理的病毒样品分别采用2%（质量分数）磷钨酸进行负染，负染后的病毒液在透射电镜（JEM-1230型，日本电子株式会社）下观察。

1.2.11 数据处理

采用SPSS 19.0软件进行试验数据的统计分析，用邓肯氏新复极差法进行数据间差异的显著性检验。

2 结果与分析

2.1 TMV质粒标准品的制备与标准曲线的制定

绘制的TMV CP和Rep基因qRT-PCR的标准曲线、扩增曲线和溶解曲线见图3。图3结果显示，标准曲线的斜率接近理想值，相关系数接近1.000。扩增曲线平滑，无非特异性扩增，未产生引物二聚体；各循环阈值间隔均匀，清水对照则无扩增。说明本研究中构建的qRT-PCR体系可靠，能够用于TMV CP和Rep基因表达量的检测。

图3 TMV CP和Rep质粒标准品qRT-PCR的相关曲线Fig.3 Correlation curves of plasmid standard qRT-PCR of TMV CP and Rep

2.2 复合亚氯酸钠处理对CP和Rep基因表达量的影响

复合亚氯酸钠处理后，TMV CP和TMV Rep基因表达量见表4。随着消毒处理时间的延长，两个基因的表达量均大幅降低。处理15 min时，两个基因仍有少量表达；处理30 min及以上时，基本没有新的CP基因表达；处理60 min时，没有新的Rep基因表达。

表4 复合亚氯酸钠处理TMV后CP和Rep基因表达量的变化①Tab.4 Expression levels of CP and Rep genes after treatment of TMW with compound sodium chlorite

2.3 复合亚氯酸钠处理对TMV抗原破坏性和侵染活性的影响

复合亚氯酸钠处理后TMV的抗原破坏性和侵染活性的变化情况见表5。处理15 min时，TMV的抗原破坏率为83%。此时的病毒粒子还存在侵染

表5 复合亚氯酸钠对TMV的抗原破坏性和侵染活性的影响Tab.5 Effects of complex sodium chlorite on antigen destruction and infective activity of TMV

活性，能够在枯斑寄主心叶烟上产生枯斑，其枯斑抑制率为80%。处理30～60 min时，TMV的CP被完全破坏，此时也完全丧失了对枯斑寄主心叶烟的侵染能力。

2.4 复合亚氯酸钠处理对TMV基因破坏性的影响

取感染TMV的烟草叶片总RNA，以T1～T6共6对引物分别进行RT-PCR检测。结果（图4）显示，TMV基因组的所有区域均可正常扩增，扩增片段的大小与预期相符。表明6对引物均具有良好的特异性。

图4 TMV基因组大片段步移RT-PCR引物对验证结果Fig.4 Validation results of primer pairs for large segment step-by-step RT-PCR of TMV genome

复合亚氯酸钠处理后TMV基因组片段的损伤结果见表6。未经药剂处理的TMV具有较强的系统性侵染烟草的能力，在6个取样位点均能够扩增出完整的基因片段。药剂处理15 min时，引物对T2在烟草茎、引物对T2和T4在接种叶上部叶片与接种叶下部叶片、引物对T6在接种叶下部叶片上没有扩增出预期大小的片段，结果均呈阴性。除此以外，引物对T1～T6在其他所有检测部位上均扩增出预期大小的片段，结果均呈阳性。药剂处理30 min时，引物对T2、T4和T6在烟草的对照叶、茎、接种叶上部叶片、接种叶下部叶片的扩增结果均呈阴性，除此以外，引物对T1～T6在其他所有检测部位均扩增出预期大小的片段，结果均呈阳性。药剂处理45 min时，引物对T1、T3和T5在烟草接种叶叶脉、接种叶叶柄和接种叶上部叶片的扩增结果仍呈阳性，其他部位的检测结果均呈阴性。表明TMV的183kDa-2、183kDa-4和CP&MP这些基因区域对消毒剂的抵抗力最弱，首先受到损伤；而183kDa-1、183kDa-3、54kDa区域对消毒剂有较强的抵抗能力。药剂处理60 min时，T1～T6在各部位基因片段的扩增结果均呈阴性，说明此时TMV的基因组被完全破坏，无法扩增出目的片段。

表6 复合亚氯酸钠对TMV基因不同片段的破坏情况①Tab.6 Destruction of different fragments of TMV gene by compound sodium chlorite

从复合亚氯酸钠对TMV的抗原破坏性和侵染活性结果可以看出，复合亚氯酸钠处理后30 min时，TMV的CP被完全破坏；TMV的灭活率为100%，表明此时TMV已经没有侵染活性。而大片段步移RT-PCR检测结果显示，复合亚氯酸钠（500 mg/L）处理TMV 30 min时，TMV相关基因结构中的183kDa-1、183kDa-2、183kDa-3、183kDa-4、54kDa及CP&MP区域还保持完整，没有被破坏。这说明复合亚氯酸钠处理导致的TMV CP损伤先于核酸损伤，核酸损伤与病毒的侵染性消失无关。复合亚氯酸钠对TMV的灭活作用主要是破坏了CP。

2.5 复合亚氯酸钠处理对病毒粒子物理结构的影响

电镜观察发现，复合亚氯酸钠处理对TMV粒子的物理结构有很强的破坏作用（图5）。未经药剂处理的TMV粒子结构完整，数量多，粒体之间表现明显聚集现象，排列整齐（图5 a）；复合亚氯酸钠溶液处理1 h后，多数病毒粒体断裂，排列杂乱（图5b）；处理1.5 h后，病毒粒体断裂成碎片状，表现分散，同一视野中数量极少（图5c）。

图5 复合亚氯酸钠处理后TMV病毒粒子的变化Fig.5 Variations of TMV virus particles after treatment with complex sodium chlorite

3 结论

用复合亚氯酸钠（500 mg/L）处理TMV后：①荧光定量RT-PCR检测发现，药剂处理30 min可以完全抑制TMV CP基因的表达，TMV CP被完全破坏，病毒也完全丧失了对枯斑寄主心叶烟的侵染能力；处理60 min可完全抑制TMV Rep基因的表达。②大片段步移RT-PCR检测发现，药剂处理30 min时，TMV的183kDa-2、183kDa-4以CP&MP基因编码区在对照叶、接种叶上部叶片、接种叶下部叶片和茎等4个部位首先受到损伤，不能扩增；在叶脉和叶柄两个部位可以正常扩增；在所有部位的183kDa-1、183kDa-3和54kDa 3个区域均可以正常扩增。药剂处理45 min时，叶脉、叶柄和接种叶上部叶片的183kDa-1、183kDa-3和54kDa区域可以正常扩增，其他3个区域不能正常扩增。对照叶、茎、接种叶下部叶片的183kDa-1、183kDa-2、183kDa-3、183kDa-4、54kDa和CP&MP基因编码区等6个区域均不能正常扩增。药剂处理60 min时，各部位基因组片段的扩增结果均呈阴性。因此，药剂处理造成的CP损伤是导致病毒侵染性消失的主要因素,核酸损伤与病毒失活不相关。透射电镜观察发现，药剂处理1.5 h后病毒粒体完全断裂成碎片状。