在线固相萃取-离子色谱法测定再造烟叶浆料中的17种有机酸

李华雨，李晓瑜，刘宁，薛建中，许红涛，王茹楠，王毅博，王宁*，高凡钦

1.河南卷烟工业烟草薄片有限公司烟草行业再造烟叶重点标准研究室，河南省许昌市金叶大道666号 461000 2.漯河市质量技术检验测试中心国家肉制品质量监督检验中心，河南省漯河市召陵区汾河路22号 462000 3.启迪浦华水务有限公司，北京市海淀区中关村东路1号院8号楼23层C2602-1 100084 4.赛默飞世尔科技（中国）有限公司北京应用中心，北京市东城区安定门东大街28号雍和大厦2号楼702-715室 100102

造纸法再造烟叶浆料中含有原料中的木质素和半纤维素，机械制浆产生的大量微小纤维，工艺过程中产生的果胶、蛋白、无机盐、有机酸及其他的阴阳离子等成分［1-2］。再造烟叶加工过程中，烟草浆料在密闭管道中运行，浆料中丰富的物质在适宜条件下滋生微生物且导致微生物种类增多［2-4］，其中的厌氧细菌在密闭环境中发生厌氧消化，释放出具有难闻气味的挥发性脂肪酸，浆料的运行时间与其挥发性脂肪酸浓度的变化密切相关［5-7］，同时再造烟叶浆料中的苹果酸、草酸、柠檬酸等通过烟梗、烟末的制浆工序以及浆料浓白水的循环使用而发生变化。因此，监控再造烟叶浆料中有机酸浓度的变化有利于保证浆料质量，同时也可为生产运行中浆料的质量评判提供一种技术手段。

有机酸的测定方法主要有GC-MS法［8-10］、HPLC法［11-12］、毛细管电泳法［13］、加压毛细管电色谱法［14］和离子色谱法［15-17］等。GC-MS法［8-10］多用于固体样品中有机酸的测定；HPLC法［11-12］多用于测定难挥发性有机酸，对挥发性有机酸测定的研究较少；毛细管电泳法灵敏度较低，重现性较差［13，18-19］；离子色谱法［15-17］测定有机酸的研究大多集中在较简单的样品体系中。传统的SPE（Solid phase extraction，固相萃取）法多采用负压真空萃取装置，萃取剂流速难以准确控制，而流速对提取率的影响较大；同时样品前处理中通常使用各种对人体有害的有机溶剂，多批次的样品前处理耗费时间较长［18］。在线的全自动化SPE系统，可提高样品处理的通量和工作效率，重现性好，准确度高，安全性强，越来越被广大实验室工作者采用［20］。本研究中针对再造烟叶浆料液色度高、浑浊、成分复杂等特点，利用在线净化及离子色谱法建立烟草浆料中有机酸的测定方法，旨在为全面了解浆料中有机酸对产品品质的影响及生产过程中浆料驻留时间和工艺优化提供技术支持，为再造烟叶产品的安全控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

TS-0006再造烟叶浆料（河南卷烟工业烟草薄片有限公司提供）。

乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；氢氧化钠（AR，天津市津东天正精细化学试剂厂）；甲酸钠（98.9%）、乙酸钠（99.5%）、丙酸钠（99.5%）、丁酸钠（99.7%）、戊酸钠（99.3%）、丙酮酸钠（99.5%）、己酸钠（≥99%）（标准品，中国药品生物制品检定所）；乳酸钠（89.9%）、异丁酸钠（99.9%）、异戊酸钠（99.5%）、3-甲基戊酸钠（99.5%）、4-甲基戊酸钠（99.6%）、苯甲酸钠（99.9%）、酒石酸钠（99.3%）、草酸钠（98.4%）、苹果酸钠（99.5%）、柠檬酸钠（99.5%）（标准品，德国Dr.Ehrenstorfer公司）。

DionexTMICS-6000高压离子色谱仪（配全自动在线电解淋洗液发生器、温控电导检测器）、ADRS600自动电解连续再生微膜抑制器（美国Thermo Fisher公司）；ZHP-2102L恒温振荡培养箱（常州普天仪器制造有限公司）；Milli-Q型超纯水仪（德国Merck Millipore公司）；MS204TS电子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司）；GL-21M高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；DionexInGuardTMNa SPE柱（9 mm×24 mm）、DionexIonPac AG11-HC离子色谱柱（4 mm×50 mm）、DionexIonPac AS11-HC离子色谱柱（4 mm×250 mm）（美国Thermo Fisher公司）；水系针头过滤器（0.22μm，天津富集色谱技术发展公司）。

1.2. 方法

1.2.1 标准溶液的配制

准确称取适量有机酸盐标准物质，精确至0.1 mg，配制成浓度为1.00 mg/mL的有机酸钠单一标准品储备水溶液。分别移取标准储备水溶液，配制成浓度为100μg/mL的混合标准溶液。移取适量混合标准溶液制成浓度分别为10.00、9.00、8.00、7.00、6.00、5.00、4.00、3.00、2.00、1.00、0.50、0.10及0.05μg/mL的工作标准溶液。

1.2.2 不同放置时间再造烟叶浆料的制备

取正常运行的TS-0006再造烟叶浆料，摇匀，15 min内分装在24个250 mL锥形瓶中，塞紧磨口瓶塞，立即放入50℃的恒温箱中。每间隔1 h取出两个平行样品。

1.2.3 样品前处理

用孔径37μm（400目）的涤纶滤布过滤再造烟叶浆料样品。取25 mL滤液并加入0.1 mL 4 mol/L氢氧化钠水溶液，混匀，以12 000 r/min离心10 min，将上清液用水系针头过滤器过滤，用离子色谱法分析滤液。离子色谱仪条件：

柱温：30℃；恒温箱温度：30℃；检测池温度：35℃；抑制器电流：160 mA；进样量：25μL。KOH淋洗液洗脱梯度：0～15 min，KOH浓度为0.8 mmol/L；15～27 min，KOH浓度由0.8 mmol/L升至4.0 mmol/L；27～28 min，KOH浓度由4.0 mmol/L升至8.0 mmol/L，保持23 min；51～56 min，KOH浓度由8.0 mmol/L升至45.0 mmol/L，保持7 min；63 min时，KOH浓度降至0.8 mmol/L；流速：1.50 mL/min。

在线前处理条件：

流动相A：去离子水；流动相B：乙腈。详见表1。

表1 在线前处理条件及阀切换时间Tab.1 Online pretreatment conditions and valve switching time

1.2.4 分析步骤

分析流程见图1。①将样品以自动进样的方式注入25μL定量环（阀2）。②样品被800μL纯水带入Na型SPE柱，重金属离子和过渡金属离子被截留在Na柱上，除去金属离子的样品从Na柱流出来后全部流入大定量环和AG11-HC预处理柱（浓缩柱），样品基质中的疏水物质被截留在AG11-HC柱上，有机酸根不被截留而进入后续的AS11-HC离子交换柱（阀1）。③乙腈将截留在阴离子预处理柱上的样品基质清洗至废液中，实现AG11-HC柱的清洗再生（阀1）。④由淋洗液将被测组分冲洗至AS11-HC分析柱，经过抑制器流入电导检测器。

图1 浆料样品中有机酸的分离分析流程Fig.1 The process of separation and analysis of organic acids in reconstituted tobacco slurry

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法的选择

2.1.1 不同类型SPE柱的选择

考察了NG1型、H型及Na型SPE柱对样品中有机酸测定结果的影响。分别在不接SPE柱、连接NG1柱、连接H型柱、连接Na型柱4种状态下测定添加了标准品的再造烟叶浆料样品。结果表明，连接H型柱时样品中乳酸、乙酸及甲酸的测定结果均比其他3种连接方式高，尤其是乙酸的浓度。这是由于H型柱的功能基是羧酸根，分析过程中其会慢慢脱落乙酸根和甲酸根［21］所致。NG1柱填料没有带电荷的功能基团，运行过程中会吸附少量的小分子有机酸，因此样品中乳酸、乙酸和丙酸的测定浓度偏低。Na型柱测得样品中乳酸、乙酸、丙酸和甲酸的浓度与不连接SPE柱基本一致。样品中其他有机酸在4种连接状态下测定结果的RSD均在5%以下。因此，实验中选择Na型在线SPE柱。

2.1.2 样品pH对有机酸测定结果的影响

离子作用力发生在带相反电荷的目标化合物与SPE吸附剂官能团之间，环境的pH是目标化合物和吸附剂带相反电荷的必需条件［20］。再造烟叶浆料系统中厌氧细菌发酵为糖酶，随浆料放置时间的不同，释放出的挥发性脂肪酸等代谢副产物的量也不同，一般再造烟叶浆料的pH为5.0～6.5。为了考察样品pH对检测结果的影响，分别利用Na型柱＋浓缩柱与仅用浓缩柱2种连接方式测定浆料样品pH分别为4.1、5.3、6.1、7.0、8.0、9.0、10.9时有机酸的浓度。结果表明，不同pH样品在仅连接浓缩柱时乳酸、乙酸、丙酸和甲酸等小分子有机酸的峰面积均较连接Na型柱＋浓缩柱时小，其中，仅连接浓缩柱状态下酸性或碱性越大的样品中乳酸、乙酸、丙酸和甲酸的测定结果越小。图2为浆料pH为5.3时2种连接方法的色谱图，连接浓缩柱时样品中乳酸、乙酸、丙酸和甲酸的峰面积均比Na型柱+浓缩柱时小。

图2 浆料样品pH为5.3时2种连接方式的色谱图Fig.2 Chromatograms of slurry sample by two connection methods at pH 5.3

离子色谱样品分析系统中，小分子有机酸仅发生静电作用，带电才能被保留；较大分子的有机酸，会发生静电吸附和分子间力2种作用。因此，小分子有机酸的检测峰面积较小有2种可能的原因：①碱性较强的样品会发生自淋洗作用而使目标组分不被净化浓缩柱保留；②pH太低的样品中小分子有机酸是分子状态，在柱子中不保留。

一般离子色谱法的分离过程中，在样品到达进样阀时，会在进样阀处连接浓缩柱，用于富集样品中的离子组分［22］。通过计算进样阀前的死体积，调整阀切换时间，加装1 mL的大定量环（约2 m长）的方法［22］，从Na型柱流出来的样品全部经过大定量环进入分析系统（图1），使在线预处理不受样品pH的影响，保证了样品浓度的准确性和测定结果的重现性。图3为pH 5.3的浆料样品在增加大定量环后2种连接方式下测定的色谱图，小分子有机酸峰面积在2种情况下均无变化。

图3 加装大定量环后空白及pH为5.3时浆料样品的色谱图Fig.3 Chromatograms of slurry sample at pH 5.3 and blank after adding a large quantitative loop

2.2 色谱条件的优化

参考高质量分数碳酸盐基体中阴离子的检测方法［22］并根据离子色谱的特点，考察了KOH淋洗液质量浓度变化对17种有机酸标准品分离的影响，草酸根与苯甲酸根［23］、碳酸根与酒石酸根［23］、甲酸根与异丁酸根易于在同一时间被淋洗，经过对淋洗液质量浓度、分离时间的优化，草酸与苯甲酸、碳酸与酒石酸均达到了基线分离（图4）。为了避免烟草原料中含有的Cl-、NO3-、NO2-、SO42-、PO43-等离子对检测结果的干扰，在标准样品溶液中添加了这5种离子的标准物质（图4）。17种有机酸与基质中5种无机酸根离子基本达到基线分离，经过在线SPE处理后的再造烟叶浆料样品中的17种有机酸与基质中5种无机酸根离子也基本达到基线分离（图5），表明建立的色谱条件及在线处理方式能够对再造烟叶浆料中的有机酸进行测定。

图4 2μg/mL标准溶液的离子色谱图Fig.4 Ion chromatogram of a standard solution of 2μg/mL

图5 再造烟叶生产浆料的色谱图Fig.5 Chromatogram of a reconstituted tobacco slurry

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察

以各有机酸根离子的色谱峰面积为纵坐标（y）、浓度为横坐标（x）绘制标准曲线。在0.5～10.0μg/mL范围内，线性相关系数（r）均大于0.999，见表2。

表2 17种有机酸的回归方程、线性范围、相关系数（r）、检出限（LOD）及定量限（LOQ）Tab.2 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients（r），limits of detection（LOD）and limits of quantitation（LOQ）of 17 organic acids

2.3.2 定量限和检出限

取适量混合标准储备液，以信噪比10∶1和3∶1分别计算检出限（LOD）和定量限（LOQ），得到LOD为0.002～0.400μg/mL，LOQ为0.010～0.900μg/mL（表2）。表明方法的灵敏度较好。

2.3.3 方法的加标回收率和精密度

以稀释后的再造烟叶浆料为原样品，在样品中以2、4、6μg/mL 3个水平加标进行实验室内回收率和精密度实验，每个加标水平重复测定3次，记录峰面积并计算加标回收率，结果见表3。3个水平平均加标回收率范围为90.5%～117.1%，重复测试的RSD为0.4%～4.4%。表明方法的准确度和精密度均能满足测定要求。

表3 17种有机酸的加标回收率和相对标准偏差（RSD）Tab.3 Spiked recoveries and relative standard deviations（RSDs）of 17 organic acids

2.3.4 精密度及稳定性实验

同一加标后经过前处理的浆料样品进行6次日内和日间平行测定，考察了方法的精密度。结果表明，17种有机酸日内、日间测定结果的变异系数分别在0.59%～2.57%、0.72%～4.80%之间。因此，该方法精密度较好。

对1个加标后经过前处理的浆料样品和1个混合标准溶液（6μg/mL）在40 d内进行周期性测试，每次测试完成后更换样品瓶瓶盖，然后在4℃条件下密封避光贮存，共测试5次。结果表明，在40 d内，再造烟叶浆料样品及混合标准溶液5次测试结果的变异系数在0.1%～4.9%之间。

2.4 不同放置时间再造烟叶浆料中有机酸浓度变化

再造烟叶浆料中，乳酸、乙酸、甲酸和柠檬酸的浓度远高于其他有机酸（如丁酸、戊酸、己酸等），如果不对样品进行稀释，浓度大的乳酸、乙酸和甲酸等的色谱峰形较差，定量准确性差。为了能够准确定量，根据样品中乳酸、乙酸和甲酸等浓度的不同将其按照不同比例稀释后测定，结果见表4。可知，再造烟叶浆料在50℃恒温箱中放置，随浆料放置时间的延长，异戊酸的浓度先逐渐升高然后逐渐降低，放置3 h时的浓度最高，9 h后浓度变化趋缓；乙酸的浓度呈逐渐升高然后无明显变化的趋势；丙酮酸的浓度在4 h时开始呈较缓慢升高趋势；4-甲基戊酸的浓度在4 h后呈较缓慢降低趋势；甲酸、酒石酸和柠檬酸的浓度随放置时间的延长无明显变化；乳酸的浓度呈逐渐降低然后无明显变化的趋势；苹果酸的浓度在放置8 h内无明显变化，然后升高再又降低；草酸的浓度放置3 h后突然升高，至6 h后无明显变化，放置7 h后突然降低，然后呈无规律变化状态。

表4 再造烟叶浆料样品中有机酸的浓度Tab.4 Concentrations of organic acids in reconstituted tobacco slurry samples （μg·mL-1）

再造烟叶浆料在50℃恒温箱中密闭放置，浆料中的厌氧细菌在厌氧消化过程中经过水解酸化和反硝化2个阶段，水解酸化阶段部分有机酸的浓度逐渐升高，反硝化阶段中又消耗有机酸［24］。实验结果表明，50℃条件下随放置时间的延长，再造烟叶浆料中乙酸和异戊酸的浓度随浆料放置时间的延长变化显著。

3 结论

（1）建立了在线固相萃取-离子色谱法同时测定再造烟叶浆料中17种有机酸的方法。

（2）该方法在0.5～10.0μg/mL范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999，方法的检出限为0.002～0.400μg/mL，定量限为0.010～0.900μg/mL。在2、4、6μg/mL 3个加标水平的平均回收率在90.5%～117.1%之间，相对标准偏差在0.4%～4.4%之间。日内测定结果的变异系数为0.59 %～2.57%，日间为0.72%～4.80%。

（3）该方法前处理简单、操作简便、重复性好，适用于再造烟叶浆料有机酸的测定，可为再造烟叶生产过程中浆料的驻留时间和工艺优化提供技术支持。