大白菜苗期根肿病抗性快速鉴定方法

赵艳艳，毛立霞，原玉香，杨双娟，魏小春，王志勇，牛刘静，李 林，张晓伟

（河南省农业科学院园艺研究所 郑州 450002）

十字花科作物根肿病是一种世界性土传病害，由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicaeWoronin.）侵染根部引起的，该菌可在土壤中存活多年，而感病品种都会被这一病原菌侵染。目前，随着机械农具的使用，根肿病传播更加迅速，已上升为影响我国大白菜产业发展的主要病害[1]，目前，该病在国内27 个省、自治区、直辖市都有分布[2]，由于长年连作和提早播种，在西南、中部、高山及沿海地区排水不良的酸性土壤中发病更为严重。随着蔬菜集约化育苗的迅猛发展，基质带菌传播根肿病的现象在河南新野、安阳、济源、原阳等地多处发生。根肿病是一种非常难以防治的病害，可导致十字花科蔬菜产量严重下降，甚至全面绝收，给菜农造成极大的经济损失[3]。同时，发生过根肿病的地块会长期带菌，无法继续种植十字花科作物，十字花科作物的可持续生产面临严峻形势，被称为是十字花科蔬菜的“癌症”，还没有非常有效的解决方法[4-5]。通过化学药剂灌根拌土、调整土壤酸碱度、添加营养元素以及生防菌等综合防治手段对根肿病有一定的缓解作用，但是费工费时，土壤板结、经济效益差、污染环境、成本高等缺点不符合国家蔬菜产业技术政策，而选育抗病品种是从根本上解决该病困扰最安全、经济有效的方法[4-9]。因此，首要任务是探究一种准确可靠、简单有效的鉴定方法。

目前，关于十字花科蔬菜抗根肿病品种鉴定已有相关报道，研究表明，大田和室内抗病品种筛选是比较普遍的2 种鉴定方法，接种根肿菌后需要30～40 d 才能够进行抗感情况调查，这2 种方法只适合少量品种筛选[10]。如果进行大批量的筛选的话则需要大面积的种植空间，费时费工。而且大田和室内鉴定无法观察到寄主体内根肿菌发生发展情况，因此需要一套更加准确高效、方便快捷、省时省工的筛选方法[11-13]。

大白菜是最易感根肿病的蔬菜品种，目前关于大白菜抗根肿病品种速鉴定方法报道较少，笔者通过对侵染后寄主体根部形态和相关指标统计分析，结合病理学指标和组织结构观察，旨在为大白菜抗病品种的筛选提出简单有效、方便快捷及准确可靠的评价依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2017 年10—12 月在西南大学植物保护学院植物细菌病害研究室进行，试验材料为经过试验鉴定为4 号生理小种的河南新野肿根50 g[3]，大 白 菜 品 种‘yx55’‘y510- 9’‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’为河南省农业科学院园艺研究所叶类蔬菜研究室自有，其中‘yx55’‘y510-9’为感病品种，‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’为抗病品种，抗根肿菌4 号生理小种。‘yx55’‘y510-9’是本研究室多年多次鉴定的根肿病感病材料，分别作为对照处理CK1 和CK2。

1.2 方法

1.2.1 休眠孢子悬浮液的制备 参照毛立霞、朱红丽等[8，12]的方法并加以改进，把保存的河南新野肿根从冰箱拿出，25 ℃黑暗处理24 h。先在料理机中加入250 mL 无菌水，然后称取50 g 解冻后切碎后的肿根，间歇性搅拌2～3 min，用8 层纱布将根肿匀浆过滤，把过滤后的液体平均倒入4 个50 mL 无菌离心瓶内，500 r·min-1离心15 min 将上清分别倒入另外4 个无菌离心瓶内；2 500 r·min-1离心5 min 弃上清，留沉淀，无菌水悬浮（重复3～4 次），再加2%氯胺T 溶液25 mL 悬浮，静置20 min 后2 500 r·min-1离心5 min，用无菌水再次悬浮沉淀重复离心2 次后，用60 mL 无菌水悬浮沉淀，再加入1 μg·mL-1链霉素、1 μg·mL-1盐酸万古霉素、6 μg·mL-1头孢塞肟钠各100 mL 摇匀，25 ℃黑暗处理24 h 后2 500 r·min-1离心5 min，重复离心3 次，最后用无菌水悬浮沉淀混匀后备用[8]。

1.2.2 孢子悬浮液浓度的计算 取10 mL 休眠孢子悬浮液分别稀释10 倍、100 倍。在25×16 规格的血球计数板分别用移液器滴上1 mL 稀释过10 倍、100 倍的悬浮液，采用五点法计数3 次孢子数量，计算出休眠孢子悬浮液的浓度，再分别加入1/2 Hoagland营养液母液5、4、1 mL 最后加灭菌水到2 L，把浓度稀释到1×107个·mL-1[12-14]。调节pH 至5.5（±0.04）。

1.2.3 试验材料的水培接种 备好灭菌的泡沫筛和10 mL 离心管，用黑色绝缘胶布缠绕离心管，放入10 mL 制备好的接菌液[14-16]。利用水培接种的方法，用直径15 mm 剪有小口的泡沫筛夹住催芽4 d的寄主苗，露出根部，浸入接菌液中，及时补充1/2 Hoagland 营养液使接菌液保持在10 mL[14-16]。

1.2.4 染色及观察 分别在接种6、10、14 d 取寄主苗根部观察根毛和皮层侵染情况[12]。先取根部用FAA 固定液固定24～72 h，固定后用无菌水冲洗掉FAA 固定液，然后用0.5%荧光桃红染色3 h，冲洗掉荧光桃红后制片，显微观察[12-14]。尽量选浸染部位都一样的10 个视野观察，每个视野观察30 个根毛，每个材料5 个处理，需要观察1 500 个根毛。分别记录浸染和未浸染的根毛数。

根毛浸染率/%=（浸染的根毛数/观察的总根毛数）×100=（浸染的根毛数/1 500）×100。

1.3 数据分析

采用Excel 2016 和SPSS 18.0 统计分析软件进行数据分析，应用最小显著差数法（LSD）进行差异显著性检验[8]。

2 结果与分析

2.1 根肿菌侵染根毛的情况

图1 接种根肿菌后不同品种白菜的根毛结构观察

如图1 所示，从图中可以直观的看到大白菜品种被侵染的根毛情况，其中被侵染的根毛数最多的是对照组感病品种‘yx55’‘y510-9’，而抗病品种‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’被侵染的根毛数则很少。如图2 所示，图中2-a 和2-b 分别是未被根肿菌侵染和被侵染的根毛，用荧光桃红染色后被侵染的根毛中病原菌呈红色，未被侵染的根毛无色；图2-c 中能够清楚的看到根肿菌已经开始侵染根毛皮层；图2-d 大白菜根毛扭曲严重，出现了次生游动孢子排空的情况。随着侵染时间的增加，5 个试验大白菜品种根毛的被侵染规律基本一致，皆是先侵染根毛，进而侵染皮层。5 个大白菜品种接菌6 d 后观察，均有根毛被侵染，侵染率分别为‘yx55’（52.67%）、‘y510-9’（50.00%）、‘y972’（13.53%）、‘y982’（9.47%）、‘14CR514M-3’（13.27%）。接种10 d，与接种6 d 相比，根毛侵染率有所上升，其中感病品种‘yx55’上升幅度最快，达到了75.80%，上升了23.13%，‘y510-9’上升了6.67%；而抗病品种‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’根毛侵染率也分别上升了14.67%、14.46%、10.13%。而在接种14 d，‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’的根毛侵染率上升缓慢，分别只上升了1%、9.47%、4.33%，侵染率分别为29.67%、33.40%、27.73%，而感病品种‘yx55’和‘y510-9’分别上升了10.2%和30.33%，最终分别达到了86%和87%的高侵染率。‘yx55’和‘y510-9’的根毛侵染高峰时段在10 d 和14 d 之间，‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’的根毛侵染高峰时段在6～10 d 之间，如图3 所示。

图2 感病品种yx55 根肿菌侵染的根毛动态

图3 不同品种不同时期根毛侵染率

2.2 根肿菌侵染皮层的情况

如表1 所示，感病对照‘yx55’的皮层侵染数从6 d 观察到的5 个，增加到10 d 的8 个和14 d 的15 个，‘yx55’的侵染高峰在6～10 d 之间，而且皮层侵染数呈现逐步递增的的趋势，在10～14 d 之间增加的数目最多。感病品种‘y510-9’的皮层侵染数从6 d 观察到的3 个，增加到10 d 的10 个和14 d 的15 个，侵染高峰在6～10 d 之间，而且皮层侵染数呈现逐步递增的的趋势，在6～14 d 之间一共增加了12 个。而3 个抗病品种中，只有‘y972’在10 d 观察时发现有2 处皮层受到侵染，在14 d 观察时，有3 处皮层侵染，其他品种则没有被侵染。

表1 不同品种白菜在不同时期的根肿菌侵染皮层的情况标统计分析

2.3 不同品种的根毛侵染率

从表2 数据显示在接种6 d、10 d、14 d 感病对照‘yx55’‘y510-9’的根毛侵染率与抗病品种‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’均有显著的差异性。特别是在14 d 时，感病品种‘yx55’比抗病品种‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’的平均根毛侵染率高52.60%～58.27%；感病品种‘y510-9’比抗病品种‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’的平均根毛侵染率高53.60%～59.27%。感病品种之间，除了接种10 d 差异显著，6 d 和14 d 无明显差异，而抗病品种之间略有差异，其中‘y982’与‘y972’在接种6 d 和10 d 时就有显著差异。

表2 不同品种根毛侵染率的显著差异性分析

3 讨论与结论

近年来，十字花科根肿病特别是大白菜、甘蓝和油菜根肿病，蔓延非常迅速，发生面积激增，给农户造成了巨大的经济损失[3，17-18]。如何准确快捷地鉴定培育的抗病品种是否抗病的需求愈发迫切，行之有效的鉴定手段可以节约大量的人力物力。以往的鉴定一般在大田和温室进行，但需要空间和时间，效率不高。大白菜接种根肿病菌12 h 后在根毛上即可观察到初级游动孢子，72 h 后能观察到皮层侵染，因此，罗延青等[18]选取在甘蓝型油菜接种根肿病菌0、12、48 和72 h 共4 个时间点，取材进行早期转录组分析，未能进行品种抗性评价。李金萍[19]虽然建立了荧光定量PCR 检测体系，但是只能对是否带菌进行检测，也不能进行品种抗性鉴定。

笔者分别对2 个易感和3 个抗根肿病大白菜品种进行根肿菌接种侵染，通过对寄主根毛进行荧光桃红染色观察，发现这5 个品种的根毛均被根肿菌侵染。朱红丽等[13]的研究表明，白菜根肿病的发病程度取决于根肿菌在寄主根毛和皮层的早期侵染水平。因此选择了接种后6、10、14 d 进行观察统计，感病品种‘yx55’和‘y510-9’的根毛侵染率与抗病品种‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’差异性显著。感病品种‘yx55’和‘y510-9’的根毛侵染率6 d 以后逐渐增加，在14 d 时分别达到86.00%和87.00%，而3 个抗病品种的根毛侵染率在10～14 d 渐渐平稳，根毛侵染率在23.40%～33.40%之间，远远低于感病品种。因此推测后期根毛浸染率增加幅度较小是由于抗病品种带有抗源。抗病品种之间略有差异，其中‘y982’与‘y972’有显著性差异，推测由于抗病品种之间也存在抗性强弱分级的差别，因此不同抗病品种之间根毛侵染率也会存在一定差异，这与田间鉴定结果一致[3,13]。感病品种‘yx55’和‘y510-9’最早被侵入，在6 d 时分别就有5 和3 处皮层侵染，在10～14 d 之间的皮层侵染数增幅最大，达到15 处皮层侵染，这也与根毛侵染率的侵染高峰相符。在抗病品种中，只有‘y972’在10 d 观察时发现了2 处皮层侵染。在14 d 观察时就增加了1 处，这也说明了‘y972’的侵染高峰在6～10 d 之间。此结果与毛立霞[8]研究的2 个白菜抗病品种的侵染趋势一致。但是与朱红丽等[12]的研究中4 个白菜品种的根毛侵染率呈现为先增后降的动态趋势有些类似却存在差异，原因可能是根肿菌生理小种不同致病性和致病程度也不同，不同品种带有的抗源也会不同，下一步将会对不同的生理小种早期侵染进行研究。且在朱红丽等[12]的研究中‘早熟长江5 号’‘华良早五号’和‘CR-春美’表现为感病，分别在不同的时间达到侵染高峰，抗病品种CR-英雄根毛侵染率最低。而本研究中根毛侵染率比较低的也是3 个抗病品种，其中接种14 d‘y982’的根毛侵染率最低，且根毛侵染都在6～10 d 达到高峰时段，而感病对照‘yx55’‘y510-9’在10～14 d 根毛侵染达到高峰时段。郭向华[20]通过甘蓝品种水培法接种首次观察到明显分化的游动孢子囊是在5 d，在13 d 时根毛侵染数达最高峰，与本试验结果基本一致。

根肿菌侵染植物分2 个阶段：初级阶段，侵染植物的根毛和表皮细胞；次级阶段，根肿菌侵染植物的下胚轴和根的皮层，最后导致宿主发育异常[18，21]。本研究通过对接种的寄主根毛进行荧光桃红染色观察，由于抗病品种带有抗源，后期根毛浸染率不再增加且较小，而且2 个抗病品种皮层未被侵染，只有‘y972’的皮层被侵染，而且高峰也在6～10 d 之间。因此选择在接种6 d 观察根毛侵染率，如果根毛侵染率低于15%，即可初步判断该品种对根肿病有抗性，如果根毛侵染率高于50%，即可初步判断该品种为感病品种。

目前对根肿病最有效的防治方法就是选育优良的抗性品种，因此有必要加快育种的步伐，尽快培育出高抗的优良品种，解决十字花科蔬菜的根肿病问题。通过观察根毛侵染这种方法鉴定抗根肿病品种不仅简单快捷而且准确高效，为抗根肿病品种的选育奠定了基础。