枯草芽胞杆菌高细胞密度发酵优化

戴 航， 丁 跃， 陈 雄， 王 志

(1 湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室，湖北 武汉 430068；2 湖北工业大学工业发酵湖北省协同创新中心， 湖北 武汉 430068；3 湖北工业大学工业微生物湖北省重点实验室，湖北 武汉 430068)

益生菌是一类定植于动物肠道、能够对宿主产生健康功效的有益活性微生物，其作用机制大致分为四类：增强肠道黏膜屏障功能[1]、阻止病原菌的黏附[2]和定植[3]、增强系统的免疫反应[4]、分泌物质[5]和改变肠道环境[6]。枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)发酵能够产α-淀粉酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶等十几种酶[7]，是被允许作为动物饲料添加剂的益生菌菌种[8-10]。因其芽胞具有极强的抗逆性，常被加工成芽胞菌粉以便运输和保存。采用高密度发酵技术大规模培养非遗传修饰菌是枯草芽胞杆菌工业生产的常用方式，而达到高密度发酵的一般标准是芽胞数达到200亿个/mL的水平。

微生物生长繁殖过程复杂，受到内外部条件共同影响[11-14]。培养基作为微生物生长代谢的营养基质，其组成成分和比例对细胞生长存在很大影响。赵达等[15]通过摇瓶发酵培养基优化，确定在3%玉米淀粉、6%豆粕等培养物下，发酵60～66 h，B.subtilisB03生物量达到105.7×108CFU/mL；陈俊煌[16]优化B.subtilisHS-09发酵培养基发现，使用复合氮源能显著提高菌落总数，在最适发酵培养基下用200 L发酵罐放大试验，有效活菌数达4.3×109CFU/mL，芽胞率90%；朱晓立等[17]研究了B.subtilisB53在前期碳限制条件下(0.4%玉米淀粉、0.2%葡萄糖)结合流加葡萄糖的补料策略，30 L罐培养26 h，芽胞数最高能达到110亿个/mL。

在枯草芽胞杆菌工业生产发酵培养基中，碳氮源是主要的组成部分，其中玉米淀粉、豆粕和蛋白胨的价格是影响发酵成本的主要因素。通过发酵培养基优化确定其比例对菌体生长效率的影响尤为重要。而发酵温度不仅影响酶活性，还影响发酵液的物理特性，从而对菌体产生影响[18]。Hecker等[19]发现热激能够诱导RelA蛋白的合成，促发严谨反应。而芽胞生成本身就是细胞对逆境应激的策略之一[20]。因此适宜的碳氮比和发酵条件以及一定的逆境条件可能会促进芽胞的生成。

基于以上分析，本研究首先在30 L罐上采用分批发酵方式探讨不同发酵策略对枯草芽胞杆菌生长的影响，确立了一种有效的发酵方法，为枯草芽胞杆菌的工业化生产提供了重要参考。

1 材料与方法

1.1 菌种

枯草芽胞杆菌HT-03(BacillussubtilisHT-03,HT-03菌株)，由发酵工程教育部重点实验室保存。

1.2 培养基

斜面培养基：酵母浸膏20 g/L，琼脂20 g/L，NaCl 5 g/L,调pH 7.5±0.1，123℃灭菌30 min；活菌数测定(平板计数)培养基同上。

30 L罐基础(对照)培养基配方为摇瓶正交实验优化后所得配方(g/L)：玉米淀粉30，豆粕60，葡萄糖5，酵母浸粉3，蛋白胨3，轻质碳酸钙3，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 2，K2HPO4·3H2O 2，MnSO4·H2O 0.3。

1.3 培养方法

1.3.1种子活化从-80 ℃冰箱的甘油管转接试管斜面，37℃培养36 h。

1.3.2种子制备向新鲜试管斜面加入无菌水，制备菌悬液，后80℃水浴10 min，备用接种，接种量为10 mL，菌体浓度为20×108CFU/mL。

1.3.3 30L罐分批发酵培养发酵体积按罐容积的60%(18 L)计，121℃，灭菌30 min。

发酵条件：恒温35℃，起始转速500 r/min，通风量1.0 m3/h，发酵8 h转速和通风量调至800 r/min、2.5 m3/h，发酵24 h转速和通风量调至500 r/min、1.5 m3/h，发酵30 h转速和通风量调至300 r/min、1.0 m3/h。整个发酵周期罐压维持在0.04～0.05 MPa。

1.3.4 30L罐发酵策略如表1所示。

表1 发酵策略设计

1.4 检测方法

1.4.1活菌数的测定发酵液活菌数(CFU/mL)采用稀释涂布平板法[21]，每间隔3 h周期取样检测。

1.4.2芽胞数的测定适当稀释的菌液经80℃水浴15 min，后进行平板涂布。

1.5 数据处理

实验数据至少是3组平行实验的均值，通过Origin 9.0对实验数据进行作图分析。

2 结果与分析

2.1 枯草芽胞杆菌在发酵策略1下的生长情况

在发酵策略1下细胞生长情况如图1所示：18～24 h菌体对数生长，其平均比生长速率μ=0.062 h-1[14]，24 h生物量达到157×108CFU/mL，芽胞155亿个/mL。

图 1 枯草芽胞杆菌在发酵策略1下的生长情况

由于芽胞杆菌对数生长会发生溢流代谢而产酸，所以pH逐渐下降，而后菌体可以利用溢流的有机酸作碳源进行二次生长[22]，再加上基质中氨基酸的消耗，因而pH从18 h的7.99持续回升至8.78(42 h)。

18～24 h溶氧(DO)持续回升至77.9%， 此时降低转速至500 r/min、 通风量至1.0 m3/h， DO降至最低值53.8% (30 h) 后快速上升。 30～42 h生物量略有增加，但μ仅有0.011 h-1。 虽然42 h生物量达到177×108CFU/mL， 但芽胞数(163亿个/mL)较30 h(155.8亿个/mL)只提高4.6%。说明：发酵后期(30 h之后)基质营养不足以满足菌体生长的需求，并引起细胞耗氧大幅下降，使DO于42 h回升至86.3%。由于30 h后碳源、氮源等营养基质不能满足菌体大量生长所需，所以生物量和芽胞数均不高，因此接下来可考虑调整碳氮源的比例来考察菌体的生长情况。

2.2 策略2对枯草芽胞杆菌生长的影响

在发酵条件、培养基其他成分不变的基础上，仅将基料中的玉米淀粉和豆粕分别提高到4%和8%形成策略2，菌体生长代谢情况如图2所示：

图 2 策略2对枯草芽胞杆菌生长的影响

18～24 h生物量从210×108CFU/mL增长到274×108CFU/mL，虽然其μ为0.044 h-1，比策略1低29%(这可能是由于对数前期菌体迅速生长所产生的代谢产物对后期生长有一定抑制作用)，但其24 h的生物量较策略1提高74.5%。

与策略1相似的是：pH从18 h(7.85)上升至发酵结束(8.89)，不同的是：24 h以后生物量和芽胞还在持续增加，说明：增加碳源、氮源的用量能够延长细胞生长周期，提高生物量和芽胞数。芽胞从21 h的185亿个/mL增加到30 h的312亿个/mL，较发酵策略1下30 h的芽胞数提高100.3%。

18～24 h溶氧持续回升至67.5%，降低转速和通风量后，溶氧基本维持稳定，30 h后开始上升至发酵终点91.3%。虽然30～42 h芽胞数有所提高，但培养12 h只提高了4.8%，42 h后维持稳定。因此在策略2条件下可考虑发酵终点选在第30 h。

虽然30 h芽胞数达到312亿个/mL，但由于基料浓度高，导致发酵液粘度增大，不仅使成本升高，而且对发酵下游加工处理带来较大困难。因此，考虑减少配方用料，考察菌体的生长情况。

2.3 策略3对枯草芽胞杆菌生长的影响

豆粕用量降至5%(发酵策略3)菌体生长情况如图3所示。

图 3 策略3对枯草芽胞杆菌生长的影响

18～33 h的生物量一直在增加，但30 h仅有119×108CFU/mL，较发酵策略2下30 h的生物量(315×108CFU/mL)减少近62%、较发酵策略1减少24%。33 h生物量达到峰值130×108CFU/mL后有略微下降。18～33 h菌体平均生长速率为6.33×108CFU·(mL·h)-1较策略2下18～30 h的平均生长速率(8.75×108CFU·(mL·h)-1)下降27.7%。18 h以后pH持续回升，但pH均低于发酵策略1和2，36 h取样结束时的pH为7.92。

18～24 h溶氧缓慢上升，24 h降低转速和通风量后，溶氧上升较快，这与菌体生长速率逐渐减小的趋势保持一致。

另外，24 h之前几乎还未形成芽胞，且30 h的芽胞数仅有94亿个/mL，较策略1和2减少40%、70%。33 h芽胞数达到108亿个/mL，此时芽孢率也仅有83%。相较于策略1，虽然玉米淀粉由3%增加至4%，但豆粕由6%减少至5%，生物量和芽胞数都有所下降，这可能是由于氮源对枯草芽胞杆菌后期的生长和芽胞生成影响较大。相较于策略2，由于培养基中豆粕减少了37.5%，所以可供菌体用于生长繁殖和形成芽胞所需的氮源大量减少，不足以维持菌体高密度发酵以及有效生成芽胞。

2.4 策略4对枯草芽胞杆菌生长的影响

既然豆粕减少至5%不能满足高密度发酵所需的条件，那么接下来可考虑微调其他氮源的用量来考察其对菌体生长的影响。

在策略3的基础上，将蛋白胨的用量从0.5%增加到0.8%形成策略4。菌体生长情况如图4所示：18～36 h生物量从122×108CFU/mL持续上升至252×108CFU/mL，平均生长速率为7.22×108CFU·(mL·h)-1，36 h后有略微增加。36 h的芽胞数(198亿个/mL)较策略3提高近82%，42 h芽胞数达到210亿个/mL，较策略1(163亿个/mL)提高29%。

图 4 策略4对枯草芽胞杆菌生长的影响

与策略3一样，18 h之后pH持续回升，但pH值均高于策略3，发酵终点45 h的pH为8.91。24 h调低转速和通风量后，溶氧维持在30%左右，这可能是由于菌体还在缓慢生长，因此6 h之内耗氧和溶氧速率基本相等，二者处于动态平衡。

蛋白胨中含有丰富的蛋白质、氨基酸、生长因子和微量元素等营养成分。微调增加了0.3%后，菌体生长速率较策略3有明显提高，且芽胞数高于策略3。

2.5 策略5对枯草芽胞杆菌生长的影响

将策略4中玉米淀粉和豆粕的用量从4%、 5%分别降低到3.5%、 4%形成策略5。 菌体生长情况如图5所示：18 h的pH值为7.43与策略4相近， 但与策略4不同的是， 30 h之前回升较快， 与溶氧变化趋势一致， 这可能是由于溢流的有机酸较少， 消耗较快， 到后期营养不足， 菌体生长变缓。 虽然18 h的生物量(94×108CFU/mL)只有策略4的77%， 但42 h生物量(236×108CFU/mL)较策略4只减少10%。42 h芽胞数较策略4仅减少6.7%，较策略1提高20.2%。策略4的36 h芽胞数为 198亿个/mL， 而策略5发酵42 h芽胞也能达到 196亿个/mL，只是发酵周期较策略4延长了6 h。因而需要考虑采用工艺参数优化来缩短发酵周期。

图 5 策略5对枯草芽胞杆菌生长的影响

2.6 策略6对枯草芽胞杆菌生长的影响

基于策略5，发酵24 h将温度从35℃升至40℃形成策略6，考察一定的逆境条件对细胞生长情况的影响(图6)：18～24 h生长情况如策略5基本一致，18 h的pH值7.37，后持续上升至发酵结束(42 h)为8.65，略微低于策略5。24 h升温后，虽然27 h生物量只比策略5高5.2%，但此时芽胞数(82亿个/mL)较策略5提高了46.4%。同时，芽胞率也比策略5提高了39%。36 h芽胞达208亿个/mL，较策略5提高42.5%。发酵24 h降低转速和通风量后溶氧依然在上升，这可能是由于菌体进入对数生长后期，胞内能量代谢水平降低，对溶氧需求逐渐下降造成。

图 6 策略6对枯草芽胞杆菌生长的影响

以上数据表明：策略6芽胞数达到200亿个/mL左右用时(36 h)比策略5减少近15%，与策略4接近，但其碳、氮源较策略4分别下降12.5%、20%，生产成本显著降低。

2.7 不同策略对枯草芽胞杆菌生长的影响

不同策略对枯草芽胞杆菌生长的影响如表2所示。

升温能促进芽胞生成效率，但对细胞生长没有促进效果(策略6和策略5)。策略1发酵42 h生物量为177×108CFU/mL，未达到高密度最低要求。即使升温缩短了芽胞生成周期、提高了芽胞率，仍不能达到高密度发酵水平(芽胞数200亿个/mL)，因此未研究策略1下升温处理对细胞生长代谢的影响。

策略2枯草芽胞杆菌生物量和芽胞数最高，24 h芽胞数就已达到251亿个/mL，但在此条件下成本较高。策略3生物量和芽胞数最低，36 h芽胞数仅有109亿个/mL。策略4发酵36 h芽胞数达到198亿个/mL，将策略4中的玉米淀粉和豆粕分别降低0.5%和1%(策略5)发酵42 h芽胞数达到196亿个/mL，虽然周期延长了6 h，但碳氮源分别减少了12.5%和20%，发酵成本降低。在策略5基础上，24 h将发酵温度从35℃升至40℃，发酵36 h芽胞数达到208亿个/mL，与策略4相近。

另外，策略6发酵36 h，细胞数达217×108CFU/mL，芽胞数208亿个/mL，其发酵效率相比赵达等[15]、陈俊煌[16]、朱晓立等[17]的报道显著提高。

表2 不同策略对枯草芽胞杆菌生长的影响

3 结论

枯草芽胞杆菌高密度发酵中，培养基和发酵条件对细胞生长和芽胞生成具有很重要的影响。本研究在已确定摇瓶水平最适发酵培养基以及发酵温度的基础上，进一步通过优化发酵策略确定了30 L罐分批发酵工艺参数：玉米淀粉35 g·L-1， 豆粕40 g·L-1，葡萄糖5 g·L-1，酵母浸粉3 g·L-1，蛋白胨8 g·L-1，轻质碳酸钙3 g·L-1，七水硫酸镁0.5 g·L-1，氯化钠2 g·L-1，三水磷酸氢二钾2 g·L-1，一水硫酸锰0.3 g·L-1，发酵24 h温度从35℃升至40℃。发酵36 h，细胞数达217×108CFU/mL，芽胞数208亿个/mL，较优化前分别提高28.4%、31.6%，实现了低成本培养基配方条件下的高芽胞率高密度发酵，为枯草芽胞杆菌工业化生产稳定芽胞率提供了重要参考。

另外，细胞是否开始形成芽胞是由内外环境条件共同决定的，与调控因子Spo0A含量和其磷酸化水平有关[23]。由于枯草芽胞杆菌呼吸代谢过程存在氧化应激[24]，而氧化应激会对电子传递链造成损伤，影响细胞的能量供应效率[25-26]。进而可能会对芽胞生成效率产生影响，因而该领域的研究有待进一步展开。