LncRNA-NKILA靶向miR-3195对口腔癌细胞活性及血管生成的作用机制

张 影, 姚曼曼, 刘珊珊, 刘铁军, 刘 昕, 仇永乐

(1.河北省石家庄市第三医院口腔科，河北 石家庄 050000 2.河北医科大学第四医院口腔科，河北 石家庄 050000)

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是全国高发的恶性肿瘤疾病，是全球第六大常见及发展中国家发病率排列第三的恶性肿瘤[1]。OSCC发生率占据口腔癌90%以上，局部侵袭性较强，可加快颈部淋巴结转移，预后较差[2]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是促血管生成因子[3]。有研究表明，上调VEGF可促进口腔癌细胞生长增殖及侵袭[4]。OSCC发生发展机制复杂，受基因水平调控。因此分析参与OSCC发病机制的相关基因，对于了解疾病发生机制及提高治疗效果意义重大。长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是长度超过200个核苷酸的RNA分子，发挥基因转录及DNA复制等作用。NKILA作为其家族成员之一，2015年首次在乳腺癌细胞中被发现，其长度为2570nt，具有抑制乳腺癌细胞活性的作用[5]。微小RNA(miRNA)是由多个核苷酸组成小分子RNA，可调节其他基因的表达，参与机体的多种疾病的发生及发展。研究发现，成熟的miR-3195与造血系统、消化系统及口颈部恶性肿瘤的发生发展相关，在喉癌细胞实验中发现miR-3195表达降低而通过上调水平能够抑制肿瘤细胞活性[6]。但是关于LncRNA-NKILA及miR-3195在口腔癌中的研究较少。本文探讨LncRNA-NKILA靶向miR-3195对口腔癌细胞活性及血管生成的作用。

1 材料与方法

1.1细胞来源:人正常口腔上皮细胞HOEC、人口腔鳞癌细胞SCC25、人口腔癌细胞株HSQ-89、人口腔癌细胞株KB细胞、人口腔癌细胞株CAL-27、人口腔癌细胞株HSC-3均购自美国菌种保存中心(ATCC)。

1.2主要试剂与仪器:LncRNA-NKILA、miR-3195慢病毒(上海吉凯制药公司)；Lipofectamine2000转染试剂(重庆市华雅干细胞技术有限公司)；DMEM高糖培养基(上海微科生物有限公司)；牛血清、0.25%胰蛋白酶均(上海素尔生物科技有限公司)；鼠抗人VEGF/VEGF-C单克隆抗体(上海圻明生物科技有限公司)；山羊抗兔IgG(武汉纯度生物科技有限公司)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒(弗元(上海)生物科技有限公司)；流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)；荧光素酶基因质粒(翌圣生物科技(上海)股份有限公司)；逆转录试剂盒及PCR试剂盒(江西江蓝纯生物有限公司)；实时荧光定量PCR仪(中山大学达安基因股份有限公司)；凝胶成像系统及Western blot电泳系统(中国北京赛百奥科技有限公司)。

1.3细胞培养:人正常口腔上皮细胞及口腔癌细胞采用10%的胎牛血清、100U/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素，的DMEM高糖培养基培养，在37℃5%的CO2饱和湿度的培养箱中培养，接种于细6孔板中，生长至80%时取对数细胞进行实验。

1.4QRT-PCR检测正常口腔上皮细胞及口腔癌细胞中LncRNA-NKILA、miR-3195 mRNA表达:将人正常口腔上皮细胞及口腔癌细胞按照1×106细胞/孔的密度接种于6孔培养板，采用Trizol法检测提取总RNA，无核酸酶溶解。将提取的RNA进行送转录为cDNA，以cDNA为模板，以β-actin为内参，采用SYBR Green试剂盒进行PCR扩增，检测LncRNA-NKILA、miR-3195 mRNA表达。LncRNA-NKILA引物序列：F：5'-CAGCAGGCAAAAATAACCAG-3，R：5'-GACAGAATCAACTTCGGAAC-3'；miR-3195引物序列：F：5'-GCGCCGGGCCCGGGTT-3'，R：5'-ACTCCCATGCCAAGAACTCC-3'；β-actin引物序列：F：5'-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3'，R：5'-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3'。反应程序为：95℃ 5min ； 95℃ 10s ，60℃30s， 72℃ 10s共40个循环；72℃10min。采用2-△△Ct法对实验数据进行分析。

1.5细胞转染及分组:PBS缓冲液将人SCC25细胞株洗净，重复3次，胰蛋白酶消化2min，离心15min后，将数目为5×106细胞平铺到6孔板中，融合率达到70%，采用无血清培养基按照3μL稀释，在37℃下孵育20min，转染按照Lipofectamine 2000说明书操作，分别将pcDNA-NKILA、pcDNA、miR-3195-mimics及miR-3195-NC-mimics转染到细胞株中，37.5℃，5%CO2继续培养。12h后将无血清培养基更换为完全培养基，继续培养24h后，提取细胞RNA，采用qRT-PCR法验证转染效率。分组：空质粒组(SCC25细胞株+pcDNA)、NEAT1组(SCC25细胞株+pcDNA-NKILA)、NC-组(SCC25细胞株+miR-3195-NC-mimics)；miR-3195组(SCC25细胞株+miR-3195-mimics)、联合1组(SCC25细胞株+pcDNA-NKILA+miR-3195-NC-mimics)及联合2组(SCC25细胞株+pcDNA-NKILA+miR-3195-mimics)。

1.6CCK-8检测各组细胞增殖率:取对数生长期的SCC25细胞按照8×103个细胞/孔的密度接种于96孔细胞培养板中，转染后，分别培养24h、48h、72h及96h，后在细胞每个培养孔中加入加入20μL的CCK-8试剂(5g/L)，CO2培养箱中培养2h，用酶标仪在490nm波长检测吸光度(A值)。细胞存活率(%)=[A(加药)-A(凋零)]/[A(对照)-A(凋零)]×100%。

1.7流式细胞仪检测细胞凋亡:收集各组细胞，漂洗后，加入500μL结合缓冲液重悬，后加入10μL的IFITC AnnexinⅤ与5μL PI 混合后染色，混匀，避光孵育10min，予以洗涤，次数3次，后采用流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.8免疫印迹检测VEGF及VEGF-C蛋白的水平:SCC25细胞培养48h，加入100μL的细胞裂解液，在冰上提取各组细胞总蛋白，测定浓度。制备SDS-PAGE，取等质量等体积的变性蛋白样品上样，电泳分离蛋白，以湿转法转膜，5%的脱脂奶粉封闭液封闭1h，用VEGF(1∶500)、VEGF-C(1∶1000)及和GAPDH(1∶2000)抗体一抗过夜，TBST洗膜后，加入辣根过氧化物酶IgG二抗(1∶2000)，室温孵育2h，TBST洗膜，加入ECL发光液，显影，在计算机凝胶成像系统中获取图像。

1.9双荧光素酶:从人类基因组DNA产生全长miR-3195′UTR，退火合成的信号寡核苷酸产生突变体miR-3195′UTR。DNA片段克隆到ph-TK载体，miR-3195′UTR WT为野生型，miR-3195′UTR MUT为突变型，均转染到细胞内，同时使用pGL-3.0(荧光素酶)作为内参照。检测细胞中miR-3195的荧光活性相对值。使用 Lipofectamine 2000 TM检测转染效率在孢菌素酶活性的基础上正常化。按照说明书，使用双荧光素酶系统试剂盒测LncRNA-NKILA对miR-3195的靶向能力。

2 结 果

2.1正常口腔上皮细胞与口腔癌细胞中LncRNA-NKILA、miR-3195 mRNA表达:与正常口腔上皮细胞相比，人口腔鳞癌SCC25细胞、HSQ-89细胞、KB细胞、CAL-27细胞及HSC-3细胞中LncRNA-NKILA、miR-3195表达均降低，其中以SCC25细胞中LncRNA-NKILA及miR-3195表达最低，故选择此细胞进行后续试验。见图1、2。

图1 正常口腔上皮细胞与口腔癌细胞中LncRNA-NKILA mRNA表达

图2 正常口腔上皮细胞与口腔癌细胞中miR-3195 mRNA表达

2.2上调LncRNA-NKILA对口腔癌SCC25细胞增殖、凋亡的影响:NKILA组细胞中LncRNA-NKILA表达升高，与空质粒组存在差异(P<0.05)，与空质粒组相比，NKILA组24h、48h及72h的细胞活性均降低，存在差异(P<0.05)。组内相比，两组SCC25细胞活性均呈现时间依赖性，与24h相比，48h SCC25细胞活性升高，与48h相比，72hSCC25细胞活性升高，存在差异(P<0.05)，NKILA组SCC25细胞凋亡率高于空质粒组存在差异(P<0.05)，见表1、图3。

2.3上调miR-3195对SCC25细胞活性增殖、凋亡的影响:与NC组相比，miR-3195组细胞miR-3195表达升高(P<0.05)，与NC组相比，miR-3195组SCC25细胞24h、48h及72h增殖率降低，组内相比，两组SCC25细胞活性均呈现时间依赖性，与24h相比，48hSCC25细胞活性升高，与48h相比，72hSCC25细胞活性升高，存在差异(P<0.05)；miR-3195组SCC25细胞凋亡率高于NC组，存在差异(P<0.05)，见表2、图4。

表2 miR-3195表达及对SCC25细胞活性的研究

图3 上调LncRNA-NKILA对SCC25细胞增殖、凋亡的影响(A：细胞增殖；B：细胞凋亡率)

图4 上调miR-3195对SCC25细胞活性增殖、凋亡的影响(A：细胞增殖；B：细胞凋亡率)

2.4LncRNA-NKILA及miR-3195对SCC25细胞活性增殖、凋亡的影响:与联合1组相比，联合2组SCC25细胞24h、48h及72h增殖率降低，组内相比，两组SCC25细胞活性均呈现时间依赖性，与24h相比，48hSCC25细胞活性升高，与48h相比，72hSCC25细胞活性升高，存在差异(P<0.05)；联合2组SCC25细胞凋亡率高于联合1组，存在差异(P<0.05)见表3、图5。

表3 LncRNA-NKILA及miR-3195对SCC25细胞活性的影响

图5 LncRNA-NKILA及miR-3195对SCC25细胞活性的影响(A：细胞增殖；B：细胞凋亡率)

2.5免疫印迹检测各组SCC25细胞VEGF、VEGF-C蛋白水平:与空质粒组相比，NKILA组SCC25细胞中VEGF、VEGF-C表达降低(P<0.05)，与NC组相比，miR-3195组SCC25细胞中VEGF、VEGF-C表达降低(P<0.05)，与联合1组相比，联合2组SCC25细胞VEGF、VEGF-C表达降低(P<0.05)，见表4、图6。

图6 各组SCC25细胞VEGF、VEGF-C蛋白水平比较

表4 各组SCC25细胞VEGF VEGF-C蛋白水平

2.6荧光素酶证实LncRNA-NKILA对miR-3195调控作用:生物信息学发现LncRNA-NKILA与miR-3195相互结合的序列，两者之间存在调控关系。为了验证LncRNA-NKILA与miR-3195的3′UTR结合，我们将两者均转染到SCC25细胞中，通过上调LncRNA-NKILA观察对miR-3195的荧光活性变化，证实：上调LncRNA-NKILA能够增加miR-3195活性，LncRNA-NKILA能与miR-3195-3′UTR特异性结合，见表5。

表5 LncRNA-NKILA对miR-3195调控作用

3 讨 论

在口腔癌中存在大量RNA表达异常，通过调控肿瘤细胞活性而发挥抑癌和促癌作用。NKILA(nuclear factor-κB interacting long noncoding RNA)是近几年被发现新型的长链编码RNA，在乳腺癌中被发现可通过激活免疫T细胞靶向抑制NF-kB而增加肿瘤细胞死亡敏感性[7]。近些年相关研究发现，miRNA在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用，miR-3195是其中之一，定位于20号染色体q13.33，认为该染色体中miRNA表达于胃癌、大肠癌及肝癌等肿瘤相关[8]。本文研究表示，在人口腔癌细胞株中存在LncRNA-NKILA及miR-3195低表达，并通过增加其活性对于减少肿瘤细胞增殖增加凋亡，但是其在口腔癌中现暂无研究。有学者证实在喉癌大鼠中通过将NKILA质粒注射大鼠体内可显著抑制肿瘤免疫，这与抑制NF-kB表达相关[9]。喉癌细胞中miR-3195表达降低有利于癌细胞增殖及转移而转染模拟物后则可抑制癌细胞生长存活加快凋亡。NF-kB在口腔癌中表达升高，其激活可参与肿瘤细胞活性，并通过上调血管内皮生长因子(VEGF)水平而加快肿瘤发生发展[10]。本文推测在口腔癌细胞中转染NKILA慢病毒载体NKILA可以通过抑制NF-kB水平而抑制口腔癌细胞增殖。利用靶基因软件预测发现miR-3195可控制的靶基因中有4个与肿瘤相关。其中之一为TBX 1具有维持细胞增殖及转化作用，在喉癌细胞中通过上调miR-3195可削弱TBX 1表达进一步抑制癌细胞增殖，但是在口腔癌是否也通过抑制TBX1发挥作用还不得而知需要进一步验证。

口腔癌细胞中VEGF及VEGF-C表达升高可增加肿瘤细胞血管生成而恶化病情。VEGF-C具有调节淋巴内皮细胞功能，在机体不同肿瘤组织均可发现表达升高表示与淋巴结转移和预后相关[11]。本文研究表示，通过上调LncRNA-NKILA及miR-3195表达后VEGF及VEGF-C表达降低，说明上调LncRNA-NKILA及miR-3195均可抑制VEGF及VEGF-C而控制肿瘤血管生长。在前列腺癌细胞中VEGF蛋白表达升高，通过表达miR-3195和miRNA374b抑制，证实其抗血管生成作用[12]。故本文推测在口腔癌细胞中通过上调LncRNA-NKILA及miR-3195均发挥抗肿瘤细胞生长作用，机制与抑制VEGF及VEGF-C表达相关。

综上所述,LncRNA-NKILA可通过调控miR-3195表达抑制口腔癌细胞增殖，促进其凋亡，研究机制可能与抑制VEGF水平相关。